抗hiv1 tat蛋白单克隆抗体的制备及初步鉴定

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1、抗HIV1Tat蛋白单克隆抗体的制备及初步鉴定【关键词】HIV1Tat单克隆抗体　　自1981年发现艾滋病以来,艾滋病（acquiredimmunodeficiencydisease,AIDS）在全球迅速扩散,人免疫缺陷病毒（humanimmunodeficiencyvirus,HIV）是引起AIDS的病原体。HIV有许多结构蛋白以及调节蛋白,其中Tat蛋白是很重要的调控蛋白之一,是HIV基因复制和表达调控所必需的［1］。Tat蛋白由2个外显子编码,其中第1个外显子编码l～72位氨基酸残基,第2个外显子编码73～101位氨基酸残基。由第1个外显子编码的72个残基的肽段具有完

2、全的体外反式激活活性。Tat是HIV最早产生的病毒蛋白之一,其入核后通过结合HIV长末端重复序列和反式激活效应元件,进一步促进病毒RNA的产生,是病毒复制的重要激活分子［2］。本研究中通过免疫BALB/c小鼠获得Tat蛋白的单克隆抗体（mAb）,并用ELISA等方法检测mAb的性质,为HIV早期检测以及抗病毒治疗提供了新的思路。　　1材料和方法　　1.1材料　　纯化的Tat蛋白由美国丹佛大学惠赠。BALB/c小鼠（6～8周龄）购买第四军医大学实验动物中心。小鼠骨髓瘤细胞株Sp2/0为本试验室保存。RPMI1640干粉培养基购自Gibco公司。小牛血清购自四季青公司。酶标山羊抗

3、小鼠IgG抗体购自TaKaRa公司。小鼠Ig亚类检测试剂盒、福氏佐剂及PEG购自Sigma公司。　　1.2方法　　1.2.1动物免疫　　取Tat蛋白28μL,加0.02mol/L的PBS(pH7.4)1.472mL使成1.5mL浓度溶液,加等量福氏完全佐剂用三通器混匀制成油包水的乳化液。在5只BALB/c小鼠的颈背部及双侧腹股沟皮下多点注射,剂量为0.6mL/只,间隔3周后以同样方法(加不完全福氏佐剂乳化)免疫,再间隔2周后取等量蛋白溶于生理盐水中经腹腔进行第3次免疫,最后1次免疫2周后测小鼠血清效价,选择血清效价高的小鼠再经腹腔加强免疫,3d后取脾细胞进行融合。　　1.2.

4、2mAb细胞株的建立　　取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0融合,融合剂为相对分子质量（Mr）1500的PEG。细胞融合及选择性培养均按常规方法［3］进行。以10mg/L的Tat蛋白包被聚苯乙烯微板,用间接ELISA法检测杂交瘤细胞培养上清,以正常BALB/c小鼠血清作为阴性对照,以免疫BALB/c小鼠血清作为阳性对照。采用有限稀释法对检测阳性孔细胞进行3次克隆化,直到克隆生长孔mAb阳性率达100％,建立单克隆细胞株。将阳性杂交瘤细胞株扩增培养后液氮冻存。　　1.2.3mAb腹水的制备及其效价测定　　取建株的杂交瘤细胞扩大培养后,以1×106个细胞接种于已注射石蜡油的

5、BALB/c小鼠腹腔中,按常规法收集、制备mAb腹水［3］。以上述间接ELISA法检测mAb腹水效价。　　1.2.4mAb的纯化　　采用正辛酸硫酸铵法对小鼠腹水中的mAb进行纯化［3］。　　1.2.5mAb的特异性鉴定不同多肽检测mAb腹水　　分别取Tat、Gp415多肽及Bcsp31蛋白,以20mg/L浓度包被微板,用间接ELISA法检测抗Tat蛋白的mAb腹水(分别以正常鼠血清为阴性对照)。　　1.2.6Ig类和亚类的鉴定　　采用小鼠Ig类检测试剂盒对所获得的mAb进行鉴定,具体方法参照试剂盒中的说明书进行。　　1.2.7mAb相对亲和力的测定　　采用间接ELISA法

6、测定［4］。以10mg/L的浓度包被Tat蛋白,加入系列稀释(200mg/L至10-8mg/L)的纯化mAb,再加入HRP标记的羊抗鼠IgG,OPD显色后测定492nm处的A值。以抗体浓度为横坐标,以A492为纵坐标,绘制曲线,观察相对亲和力。　　1.2.8抗体相加实验分析mAb针对的抗原表位　　确定各mAb反应饱和浓度后,将各株mAb稀释至100mg/L(该浓度均大于各mAb反应的饱和浓度)。以2mg/L浓度包被Tat蛋白,分别将各株mAb两两相加后加入微孔板,另外各有一孔只加单独一种mAb。再加入酶标羊抗鼠IgG,并经显色后测定492nm处A值。相加指数按公式AI=［2A

7、1+2/(A1+A2)-1］×100％计算。公式中A1和A2分别为单独加1株mAb的A值,A1+2代表2株mAb相加所测得的A值。AI大于50％表示具有相加效应,提示2株mAb针对不同抗原表位;AI在10％～50％之间表示2株mAb针对的抗原表位可能有差异;AI小于10％则表示2株mAb针对的抗原表位相近。　　2.2腹水及纯化mAb效价测定　　上述3株mAb（A10、E2和C10）腹水经纯化后的mAb浓度为0.263g/L、1.689g/L、0.908g/L,经ELISA法检测其腹水效价均为1∶200,