抗人masp2-c蛋白单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

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1、南方医科大学2010级硕士学位论文抗人MASP2．C蛋白单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用Preparation，characterization，andinitialapplicationofmonoclonalantibodiesagainstMASP2-C课题来源：广州市科技计划项目学位申请人敖会芳导师姓名陈政良教授专业名称免疫学培养类型学术型培养层次硕士研究生所在学院基础医学院答辩委员会主席金伯泉教授第四军医大学答辩委员会成员龚非力教授华中科技大学吴长有教授中山大学郑利民教授中山大学涂文伟教授香港大学向军俭教授暨

2、南大学富宁教授南方医科大学雷丁教搜_南力医科大竽论文评阅人马骊教授南方医科大学邢飞跃教授暨南大学2013年4月26日广州欹蒲吴贿教该吁括函!缸：教会芳圳弘于≯硕士学位论文抗人MASP2．C蛋白单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用硕士研究生：敖会芳指导教师：陈政良教授摘要对病原体是否易感取决于机体的抵抗力，而天然免疫是抵御病原体入侵的第一道防线。近年来天然免疫研究迅速崛起，提示从天然免疫的角度审视感染性疾病及其防治，可能会有意外收获。补体激活的第三条途径——凝集素途径为天然免疫系统中的重要成分，而甘露聚糖结合凝集素(mann

3、an．bindinglectin，MBL)相关丝氨酸蛋白酶2(MBL．associatedserineprotease2，MASP2)是其关键蛋白酶【lJ。MASP2与Clr、Cls同属丝氨酸蛋白酶超家族12J，在血浆中以酶原形式存在。已发现MASP家族3个丝氨酸蛋白酶：MASPl、MASP2、MASP3，以及2个非酶蛋白：MApl9、MAp44：其中MASP2、MApl9是同一基因的差异剪切产物，MASPl、MASP3及MAp44也来源于同一基因的不同剪切【3J；五者均可与MBL形成大分子复合物(MBL．MASPs)

4、。MASP2分子为单肽链，从N端至C端由6个功能区组成，依次为：CUB区(complementsubcomponentClr／Cls．1ikedomain)、EGF区(epidermalgrowthfactor-likedomain)、CUB区、2个CCP区(complementcontrolproteindomain)、SP区(serineproteases)‘4，川。研究表明，MASP蛋白N端及C端的功能相对独立：MASPN端的3个结构域即2个CUB区和1个EGF区是MASP与MBL—CLR结合的区域，能以Ca2+

5、依赖方式与MBL相互作用，形成MBL．MASPs复合物；而C末端的3个结构域即2个CCP区和中文摘要1个SP区是丝氨酸蛋白酶的活性中心，激活补体主要依靠SP区发挥丝氨酸蛋白酶的作用，裂解补体C4和C2，产生C3转化酶【61。在凝集素途径中，MBL／纤维胶原素与MASPl／MASP2等组成类似C1的复合物，前者通过CRD识别并结合病原微生物表面的甘露糖、N-乙酰葡萄糖等相应糖结构后，后者相继被激活，活化的MASP2裂解补体C4和C2形成C3转化酶C4b2a，由此形成补体激活凝集素途径。故MASP2为MBL和几种(H、M和

6、L)纤维胶原素激活补体所必需，在凝集素途径中发挥至关重要的作用‘7—1。近来研究表明，血清MASP2含量的变化与感染性疾病、肿瘤、自身免疫性疾病等多种疾病密切相关。MASP2基因GACl20GGC点突变导致编码产物由天冬氨酸(Asp)变为甘氨酸(Gly)，该点突变位于CUBl结构域，可引起血清MASP2浓度降低或缺失，且突变MASP2蛋白与MBL及纤维胶原素的结合力降低，使免疫识别复合物分离，导致不能激活凝集素途径，从而引起或加重病原体的感染【91。已有研究表明，血清MASP2水平是预测结直肠癌复发、存活时间的独立标志

7、【10】：其也与食管鳞状细胞癌的进展以及肿瘤的侵袭性密切相关⋯。此外，MASP2基因多态性也与HCV易感性相关，HCV患者血清中MASP2浓度增甜圯1。现有资料表明，不同地域、不同种族人群，其MASP2基因不同位点存在的点突变具有明显差异，突变频率、血清水平也存在差异。而目前国内并无中国人或各民族MASP2血浆浓度、与天然免疫及相关疾病的关系较全面的报道。由于MASP2具有上述重要作用，有必要对其进一步深入研究，而MASP2单克隆抗体(单抗)便是重要的工具之一。本研究以纯化的重组人MASP2．C蛋白为抗原，制备了特异性

8、识别人MASP2．C端蛋白的单克隆抗体，通过WesternBlot、ELISA证实单抗特异性好，灵敏度高，具有一定的生物学功能。而关于人血浆MASP2浓度的测定方法，目前国内未见相关报道，本研究利用抗MASP2．C单抗及多抗，建立双单抗、单多抗及多单抗夹心ELISA法检测人血浆MASP2浓度，筛选并优化最佳体系，初步可用于检测人血