人表皮生长因子hegf在螺旋藻中的表达研究

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1、厦门大学硕士学位论文人表皮生长因子hEGF在螺旋藻中的表达研究姓名：郑晓欢申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：章军20090801摘要摘要表皮生长因子(EpidermalGrowthFactor，EGF)是由53个氨基酸组成的多肽。因具有多种生物学活性和广泛的临床应用前景，EGF及其受体家族的研究成为近年来生物学研究的热点之一。螺旋藻是一类特殊的原核生物，它作为一种天然绿色食物，具有高安全性和高营养价值的特点，有着巨大的应用开发潜力。本实验的目的在于实现人表皮生长因子在螺旋藻中的表达，省去下游的分

2、离纯化，以期开发出外敷产品应用于美容和皮肤烧伤、创伤的治疗、直接口服的美容保健品。首先，构建用于转化的供体表达载体。根据螺旋藻密码子的偏嗜性，设计引物，用PCR技术扩增得到人表皮生长因子基因。利用^印I和勋向I这两种同尾酶，经过多步链接、测序，构建成含有四个串联目的基因的重组载体。然后将此串联片段插入到含有蓝藻源的热休克groESL启动子、rbcSp01yA终止区、同源重组片段recA基因和nptII基因的质粒中，构建成供体表达质粒pKREGF4。其次，将构建好的供体表达质粒转化螺旋藻。我们将供体质粒用超声转化的方

3、法转化钝顶螺旋藻，通过G418筛选，得到三株具有G418抗性且生长良好的转化藻株，分别命名为EGFA，EGFBJEGFc。以外源片段两侧引物对转化藻株的基因组DNA进行PCR扩增，证明目的片段已经整合到宿主的基因组DNA中。转化藻通过41℃热诱导后，进行SDS—PAGE，通过Western_blot，发现EGFB，EGFC藻株存在与预期外源目的基因表达产物大小相当的8．87kD左右的特异杂交带，证实特异蛋白的存在。而EGFA可能由于外源目的基因表达量过低或者基因未表达，没有检测到杂交信号。我们选取生长状态较好的转化

4、藻EGFC进行大量培养，为后期验证转基因藻功能的动物实验做准备。最后，我们通过乙酸诱导大鼠急性胃溃疡的实验，初步证明转基因螺旋藻在治疗大鼠急性胃溃疡方面有一定的功效，转基因藻的治疗效果好于野生藻，体现了转基因螺旋藻藻的优越性。本研究通过超声转化的方法将目的基因人表皮生长因子llEGF片段整合到螺旋藻勋护甜砌口p扬纪凇括染色体上，并且从DNA和蛋白质水平检测了目的基因的表达情况，首次尝试了以螺旋藻作为转基因受体表达人表皮生长因子，为进一步研究开发具有人表皮生长因子功能的转基因螺旋藻产品奠定了基础。关键词：人表皮生长因

5、子(1lEGF)；转化表达；螺旋藻AbstractExpressionofhEGFin．5汐扣髓砌口p砌姗s豇H岫anepidemmlgrowtllfIactor(hEGF)isa53a“noaCidpeptide，w11ichacts硒agrowtllf．actorona证deV撕et)rofceU够pes．Duet0itsessentialbiologicalfhctionand、ⅣideSpectnlII】applicationonclmic，itisthehotspottos眦yhEGFanditsrece

6、ptorSintlleresearchfieldofbioche血st巧andmolecularbiology．印护甜，f撇p砌P瑚括areadiVerseandwidelydistributedgroupofprokaryoteswitllrichproteill觚d肌trition．InrecentyearsnlerehaSbeenr印idprogressesontllegeneticengine耐ngofspimlm．In仳sstudy，t11enucleotidesequenceofllEGFwasobta

7、血edbyPCRandsubclonednoplasrIlidpUCMTl、ⅣhichcontainedgroESLpromoter，KananlycinresistaJlcegene(nptII)，recAgeneauldrbcs—polyAteminator，tllusmeexpressionVectorpKREGF4waLsconstmcted．Then“srecombinantdonorplaSmidwast啪sfo肌edinto印护材，f舰p肠纪淞括throughultrasonicn。eatmentan

8、dmethreetransfo期旧ntswercobtailledbyG4l8scree血g，n锄edEGFA，EGFB，EGFC．ResultsofPCRshowedthatthetargetnucleotidehadbeengeneticallyintegratedintogenomeDNAofhostcenbyintegrationVectors．Fu