人表皮生长因子在转基因蓝藻中的调控表达

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1、山东师范大学硕士学位论文人表皮生长因子在转基因蓝藻中的调控表达姓名：张大伟申请学位级别：硕士专业：发育生物学指导教师：赵彦修;张慧2002.4.20hEGF在转基因藻中的调控表达摘要人表皮生长因子(hEGF)是由53个氨基酸组成的多肤类细胞因子，可以抑制胃酸的分泌和促进表皮细胞的增殖，重组hEGF基因已经成功的在大肠杆菌、酵母和蓝藻等载体内得到表达。蓝藻是一类具有放氧型光合作用的原核生物，并同高等植物一样也具有光系统工和光系统II，由于蓝藻细胞带有许多有益的成分，以转基因蓝藻作为hEGF表达载体，其培养物的粗提物

2、可以作为一类主要的成分来制备口服药物和化妆品。为了在转基因蓝藻中得到hEGF更高水平的表达，本研究利用PCR技术，将鱼腥藻7120的psbA基因的SD序列连至hEGF基因的上游，并将此合成基因插入PCR产物专用质粒载体pMD18-T，构建了pMD-S。另外利用同样的技术，将聚球藻7942psbA工工I基因的启动子及其mRNA5’端非翻译区域的一段核昔酸序列插入质粒载体pMD18-T，构建了pMD-PE。这段插入序列被称为P工工工启动子，它包括两个顺式作用元件，即:基本启动子序列和对光强敏感的增强子序列。在聚球藻7

3、942psbA工II基因的表达中，它可以被强光迅速诱导后，可明显的提高基因的转录水平。为了解光控顺式作用元件在鱼腥藻7120中的调节机制，并得到更高水平hEGF的表达，本研究在大肠杆菌中构建了以下四种包含不同表达单元的重组质粒:工.pRL-EGF:将没有SD序列的hEGF基因插入到质粒pRL439的PpsbA启动子的下游，构成hEGF的表达单元;‘II.pRL-S:将带有SD序列的hEGF基因插入到质粒pRL439的PpsbA启动子的下游，构成hEGF的表达单元;工II,pMD-PES:将P工II启动子连到SD-

4、hEGF的上游，启动hEGF基因的转录表达;IV.pRL-PS:将P工II启动子连到质粒pRL-S中PpsbA启动子的上游，以复合的双启动子控制带有SD序列的hEGF基因的表达。在以上表达单元中，PII工启动子都是以正确的方向插入的。利用放射性免疫法对以上几种重组大肠杆菌表达产物的粗提物进行测定，结果表明:质粒pMD-PES在大肠杆菌中对hEGF的表达水平最高，其次为pRL-PS和pRL-S，而在pRL-EGF的样品中没有检测到hEGF的表达。根据以上筛选结果，本研究利用穿梭质粒pDC8和以上表达单元，构建了穿梭

5、表达质粒pDC-PES,pDC-PS和pDC-S,利用相同方法对三种穿梭表达质粒在大肠杆菌中的hEGF基因的表达水平进行了测定，结果表明pDC-S的表达效率远低于pDC-PES和pDC-PS.通过三亲接合转移，本研究将穿梭质粒pDC8,pDC-PES和pDC-PS转入鱼腥藻71200经过在带有新霉素抗性的SG-11(-N)固液体培养筛选，三种不同的转基因鱼腥藻被纯化分离，利用特定引物进行的PCR试验的鉴定结果证明了以上三种穿梭质粒被成功地转入鱼腥藻7120中，并能够稳定地进行复制扩增。为了进一步了解Pill启动子

6、在转基因鱼腥藻中，对hEGF基达的调控本论文在多种培养条件下(包括不同培养基成分和不同的光照条分别对不同转基因藻的表达产物进行了放免测定，在利用放免结果分析P工工I启动子的调控机理时，野生型鱼腥藻712。和转pDC8的重组鱼腥藻被分别用于阴性对照和阳性对照。研究结果显示:I，穿梭表达质粒PDC-PES在转基因鱼腥藻中，hEGF的最高表达水平为261.28ng/ml培养液;而测定的穿梭表达质粒PDC-PS的最高表达水平为77.52ng/mI培养物。以上表达水平在已发表数据中是最高的:11向8G-11(-N)培养液中

7、添加氮源，用NaNO，代替Na2CO3，可使hEGF在转基因藻中的表达效率明显提高;I工工.虽然P工工I启动子在质粒PDC-PES和pDC-PS中的位置不同，hEGF在转基因藻中的表达却都可以被强光所诱导，并分别增加1-4倍。在本研究中，两种穿梭表达载体被用来研究与光强相关的顺式作用元件的调控原理，结果表明，无论在强光还是弱光下，PI工工启动子均可使hEGF基因在转基因鱼腥藻中进行表达，而且不管在单一型还是复合型启动子中，只要有PI工工启动子的存在，hEGF基因便可在转基因藻中被强光诱导，并增强表达。这种增强作用

8、在一定范围内不受位置的限制，但受方向的限制。在质粒pDC-PES中，在基本启动子下游，位于mRNA5’端非翻译区域的序列(+1"+39)与表达的增强有关。同时本论文还证实了SD序列是转基因鱼腥藻表达外源基因所必需的。本研究有关hEGF墓因在转基因鱼腥藻中的表达效率是以前发表的表达水平的50多倍，有利于将转基因藻表达的hEGF产品以较低的成本应用于口服药物和化妆品的生产。r