人表皮生长因子（hegf）在大肠杆菌中的表达与其多克隆抗体的制备

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1、摘要人表皮生长因子是由53个氨基酸组成的小分子量单链多肽类细胞因子，它对酸和热稳定。它的显著生物学效应是能够促进内外表皮细胞的生长，在临床上可用于治疗烧伤、创伤、角膜的移植、胃酸、十二指肠溃疡等；还可用于化妆品。由于其具有特殊的生物学效应使其有很大的潜在经济效益。1960年Cohen首次从小鼠颌下腺中发现了表皮生长因子，之后的40几年又陆续在人体和哺乳动物中发现了与表皮生长因子结构与性质相近的生长因子，转化生长因子Q(TGFQ)、牛痘病毒生长因子(VGF)、休普氏纤维瘤生长因子(SFGF)、粘液瘤生

2、长因子(MGF)、两性调节蛋白(锄piregulin)、双向调节素(arnphireguli，AR)、表皮调节素(epiregulin，Epl)、结合肝素的EGF样生长因子(HB—EGF)、痘苗病毒生长因子(VVGF)等，大小都在50～80个氨基酸之间，在一级结构上有20％～90％的同源性，它们都含有六个半胱氨酸，形成3对二硫键和表皮细胞生长因子受体结合且具有相似的生物活性，构成了表皮生长因子家族。本实验运用PCR技术人工合成了人表皮生长因子hEGF的成熟肽DNA序列。将其克隆到pGEM-T载体上，

3、测序正确后将其克隆至pGEX一2T融合表达载体上构建了重组质粒pGEX一2T咄EGF。经测序后正确的重组子转化入BL21(DE3．0)表达宿主菌中，加入终浓度为1．0IIlM的异丙基一B—D一硫代半乳糖苷(isopropyl—B—D—thiogalactoside，IPTG)诱导表达GST_hEGF融合蛋白，融合蛋白表达量占菌体总蛋白30％以上。经SDS—PAGE电泳，经KCl染色后将分离纯化的原核表达的GST_hEGF的目的条带切下。用液氮研磨成粉末，将含10～20ug融合蛋白的凝胶粉末与弗氏佐剂

4、混匀后，免疫BALB／c小鼠。制备了GST-hEGF融合蛋白的多克隆抗体，抗体以1：10000稀释时能够明显检测出细菌总蛋白中的GST-hEGF融合蛋白和纯化的EGF—PEA—scFv融合蛋白。关键词：人表皮生长因子；pGEM—T；pGEx一2T；GST．hEGF；原核表达；多克隆抗体AbstraCtH砌肌印idemalgrowth蠡璩torisasmallsingle-chainpolyp印tideof53aInin0acids．Itisheat-a11dacid-s切ble．Them萄orbio

5、lo舀cal缸1ctionistostiInulatemegrowthaIldproliferationof印ide肌al锄d印ithelialcell．nisoRen印pliedtotreatbunls，scald，comea妇nsplaIlt，gastricacid，duodenalulcereda11dalsousedaScosmetics．SmeCohenfirstlydiscoVeredepidemalgrowmfactor(EGF)舶mamouseiIll960，maIlygro、)l咀

6、lf．actorshaVebeenidentifiedonemer觚othermainly舶mh【maIlaIldmaⅡ曲illasuchastmsf．o肌inggrowthf．actom(TGFa)，VacciIliagrowthfktor(VGF)，sh叩e舶romagro叭hf．actor(SFGF)，myxomagrowthf．actor(MGF)，锄piregulin，锄叩hireguli(AR)，印iregulin(EPl)，h印碰n-bin百ngEGF-likegrowthf．acto

7、r(HB-EGF)，VaCciniaVilllsgrowcllfIactor(WGF)．TheyhaVe50-80alTlinoacids肌dhomologyabout20％~90％inprimar)rstnlcture．IntheirmoleculestherehaVeconservatiVelysixcysteines，wllichfo咖nlreedisulfidebonds，II讲【etheirbindtoEGFrec印torinducingsi血larbiologicalactiVity．T

8、hesemoleculesaredeflned2Lsa11EGFf．amily．InthisstIldyusingPCRtecllIlolo鼢wehavemaIluallys)，IIdlesizedtheDNAsequenCeformatllrepeptideofhEGF．nwascloncdi11toVectorpGEM-TarldtheninsenedintomeeXpressionVectorpGEX-2Tresultingtherecombinationpla