杆状病毒acmnpv+orf142基因的表达与其多克隆抗体的制备

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1、钟俊锋中山大学硕士学位论文杆状病毒AeMNPVorf-142基因的表达及其多克隆抗体的制各导师：王殉章教授专业：生物化学与分子生物学摘AcMNPVo@142基因是杆状病毒共有的29个核心保守基因之一，位于AcMNPV基因组123632m～125065nt之间，阅读框全长1434bp，编码477个氨基酸，理论分子量为49kDa，故又名Ac一49k，该基因位于ieO内含子区域，其功能未知。序列分析表明，在目前已知的26株以磷翅目昆虫为宿主的杆状病毒基因组中都存在与orf-142基因相似的基因。启动子预测分析显示该基因启动子同时包含有早、晚期启动子的核心元件TATAA¨．．CATT和ATAAG。前

2、人预测ieO基因以早期启动子模体TATAA⋯CAGT进行转录，但并不清楚o,f-142基因是以早启期子还是以晚期启动子进行转录。本研究的主要工作是制备了抗Ac一49K的多克隆抗体以检测orf-142基因的原位表达时相。首先，本研究克隆并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了AcMNPVoCl42基因：利用PCR技术将oCl42基因的完整ORF从AcMNPV基因组中扩增出来，并连接到pET-28a载体上；构建成大肠杆菌重组表达载体pET28a—orfl42；再用IPTG诱导被转化的E．coliBL21(DE3)表达Ac．49K重组蛋白，经超声破碎后，SDS—PAGE分析表明表达产物以不溶性的包涵

3、体形式存在。接着，本研究将off-142基因在大肠杆菌中的表达产物经SDS—PAGE纯化后，钟俊锋中山大学硕士学位论文作为抗原免疫雄性昆明小鼠，制备得到较高效价的抗Ac．49K的免疫血清。经初步纯化和去除交叉反应性抗体后，该血清显示了良好的特异性，可作为进一步研究AcMNPVD币142基因功能和分子机制的辅助材料。最后，用所制备的免疫血清通过Westernblot免疫印迹法检测了感染AcMNPV后不同时间点的草地夜蛾细胞Sf9中orf-142基因的表达情况，结果显示与预期相符的约49kO的Ac一49K蛋白在感染后24小时即可检测到，在24至72小时之间达到最高水平，该基因的表达时相完全符合晚

4、期基因表达的特征。但检测结果显示该基因在整个感染过程中维持低水平表达，表明其启动子可能是个晚期弱启动子。本研究所做工作的意义在于为用免疫学手段来进一步研究AcMNPVorf-142基因的功能提供了必要的辅助材料一抗Ac一49K的免疫血清，并对AcMNPVorf-142基因在受感染细胞内的表达做了初步的探索：关键词杆状病毒，AeMNPVorf-142，多克隆抗体，表达时相塑丝堡!些查兰堕主兰竺笙苎Expressionoforf-142GenefromAutogrphacalifornicamultiplenuclearpolyhedrosisvirus(AcMNPV)andPreparatip

5、nofAnti-Ac一49KAntiserumZhongJunfengMajor：Biochemistry&MolecularBiologySupervisors：Pr．WangXunzhang，Ph．D．Abstract。矿142,ageneofautogrphacalifomicamultiplenuclearpolyhedrosisvirus(AcMNPV)isamemberofthe29baculoviruscoresetgenes．Sequenceanalysisindicatedthat26of29currentlysequenced[epidopteranbaculovirus

6、esgenomeshavegenessimilaritytooffl42，Thisgene’SORFishighlyconservedandlocatedbetweenntl23632andntl25065ofAcM2qPVgenome，eomainmg1434bpandcoding477aawithpredictedmolecularwei}ght49kDa．So，ithasanothernameac一49k．ThegenesequenceisanintronofgeneieO,wlfichmRNAistheonlyknownsplicedgeneproducttranscriptsfro

7、mtheAcMNPVgenome．Theo矿142promotercontainsbothearlyandlatetranscriptionalstartmotifs(TATAA⋯CATTandATAAG，respectively)．PreviousanalysishadshownthatieOtranscriptioninitiatedattheearlypromotermotifTATA⋯CAGT，but