d氨基葡萄糖盐酸盐诱导人胃癌细胞sgc7901凋亡机制的实验研究

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1、D．氨基葡萄糖盐酸盐诱导人胃癌细胞SGC．7901凋亡机制的实验研究曹秀明，张珍珠，马娇(哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心，国家教育部抗肿瘤天然药物工程研究中心，哈尔滨150076)摘要目的：研究D．氨基葡萄糖盐酸盐诱导人胃癌细胞SG-C．7901细胞的凋亡及其作用机制。方法：采用细胞生长抑制试验(SI淝)、细胞周期及凋亡检测试验观察D．氨基葡萄糖盐酸盐对SGC．7901细胞的生长抑制、并诱导其凋亡情况。测定经D．氨基葡萄糖盐酸盐作用后SGC．7901细胞内钙离子浓度的变化，考察细胞内钙调神经磷酸酶的表达的变化。结果：D．氨基葡萄糖盐酸盐能够抑制SGC．7901细胞生长

2、，诱导细胞出现凋亡现象，细胞内钙离子浓度在48h达到最大，同时对钙调神经磷酸酶的表达也有显著的促进作用。结论：D．氨基葡萄糖盐酸盐使SGC．7901细胞内钙离子浓度升高，并促进钙调神经磷酸酶的表达，可能是其阻滞周期并诱导细胞凋亡的机制之一。关键词：D．氨基葡萄糖盐酸盐；胃癌细胞SGC．7901；细胞凋亡D．氨基葡萄糖盐酸盐(DAH)是氨基葡萄糖的一种稳定化合物，它可以利用从废弃的虾、螃蟹和昆虫等节肢动物的外壳中提取的甲壳素在盐酸溶液中充分水解而制得。D．氨基葡萄糖盐酸盐在医药上有着广泛的片j途，它具有促进抗生素注射效能的作用，可供糖尿病患者作营养补助剂，代替皮质醇治疗肠炎，不但

3、对治疗风湿性关节炎、乙型肝炎等有一定疗效，而且还是合成新型抗癌药物氯脲酶素的主要原料‘1，射。胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，本实验旨在体外研究D．氨基葡萄糖盐酸盐对SGC．7901细胞凋亡的作用机制。l材料与方法1．1药品和试剂GAH(中国海洋大学刘万顺教授惠赠，纯度98％用RPMll640配成相应浓度待片j)。紫杉醇，上海华联制约有限公司；胎牛血清，杭州四季青生物jI：程材料有限公司；RPMI．1640培养基，Hyclone公司；胰酶，Gibico公司；Fluo．3／AM，MolecularProbes公司；小牛血清白蛋白(BSA)Sigma公司；Pan．Calcineur

4、inAAnti．body，SantaCruz生物技术公司；山羊抗兔Ig．G．FITC，北京中杉金桥生物技术公司；其他均为国产分析醇：人胃癌细胞株247(SGC．7901)由哈尔滨医科大学肿瘤防治所提供．t．2方法胃癌细胞培养于含体积分数为10％胎牛血清的RPMI．1640培养液中，置于37"C，5％Cth培养箱中进行常规传代培养，用2．5g·¨1的胰酶消化传代，取对数生长期的细胞用于实验。1．2．1细胞生长抑制实验(sRB法)调整细胞密度5x107个·L-1，接种于96孔板，每孑L100此，培养过夜贴肇，分别用不同剂鹫的GAH(4，2，l，0．5，O．25mmol·L。)100

5、此处理肿瘤细胞，设紫杉醇阳性对照组，空白对照组加100此RPMI．1640，每个剂量接种6个复孔，置于细胞培养箱中培养24、48、72h后，同时在24h设置T0组，加入三氯乙酸同定1h，自来水反复冲洗，自然风干后，加SRB染色20min，后加1％醋酸反复冲洗，晾干后加"Iris(pH=10．5)，用酶标仪(A．---490rim)测定4值，同时计算细胞的50％生长抑制所需的药物浓度(G150)。细胞生长抑制率％=(实验组A值．To)／(对照组么值_To)×100％，绘制餐效曲线，测定G150．1．2．2细胞周期及凋亡率测定调整细胞密度2×108个·L-1，培养于6孔板中，培养过

6、夜贴壁，实验组用GAH(剂量为测定GIso值)处理肿瘤细胞，设紫杉醇阳性对照组，空白对照组不处理，每组设3个平行孔，分别在24，48，72h收集个组细胞，PBS离心洗涤后加入70％冰乙醇4"C固定，加入含RNA酶的碘化丙啶染液(50g·L-1)800皿混匀，4"C避光放置30min，流式细胞仪检测细胞周期分布及细胞凋亡率。1．2．4细胞内钙离子浓度测定调整细胞密度2×108个·L．1，培养于6孔板中，细胞贴壁后实验绍用GAH(剂量为测定GIso值)处理肿瘤细胞，每组设三个平行孔，设紫杉醇阳性对照组，空白对照组不处理，分别在24，48，72h收集个组细胞，PBS冲洗离心去上清液，

7、加入含有4lunol·L～fluo一3／AM和lmLPBS的溶液中，37℃避光负载30min，再用无钙台式液洗涤3次，将负载好的细胞在激光共聚焦显微镜上检测细胞内游离的ca2+浓度变化，并拍片，以其中20个细胞作方差统计。1．2．5细胞中钙调神经磷酸酶(CaN)的表达的测定调整细胞密度2×108个．L～，培养于6孔板中，细胞贴壁后实验组刚GAH(剂量为测定G150值)处理细胞，每组设三个平行孔，及紫杉醇阳性对照组，空向对照组加入等体积的RPMI．1640，培养48h(本实验结果中此时间点Ca