肾小管上皮细胞分离实验研究

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1、精选公文范文管理资料肾小管上皮细胞分离实验研究　　目前大量关于肾的毒理学、药物测试等研究需要肾小管上皮细胞株。但是，细胞株部分基因的变异或缺失与正常细胞存在差异，原代细胞在表达正常细胞生理状态下则更显优势[1],因此寻求一种有效的肾小管上皮细胞的原代培养尤为重要。目前多篇文献[1-7]对肾小管上皮细胞的原代培养都有各自见解，本实验将其简化并加以改良，在文献的基础上[2]优化实验条件，寻找经济材料以及合适的浓度以获得大量良好的肾小管上皮细胞。在试验中发现将第一次细胞换取液可再次利用，仍有大量高纯度的肾小管上皮细胞贴壁且

2、贴壁良好。　　1材料与方法　　1.1材料　　实验动物：SD大鼠，雄性，4~5[键入文字][键入文字][键入文字]精选公文范文管理资料周龄（徐州医学院实验动物中心）；昆明小鼠，4~5周龄（徐州医学院实验动物中心）。　　1.2主要试剂胎牛血清（杭州四季青），DMEM-F121:1培养基（Thermo），Ⅰ型胶原酶（美国Sigma），胰酶消化液，双抗（青霉素-链霉素溶液100×），兔抗人角蛋白CK18（Bioss），SABC免疫组化染色试剂盒（博士德生物），DAB显色试剂盒（博士德生物）。　　1.3试验方法　　1.3.1肾

3、小管节段分离　　大鼠和小鼠实验前均禁食12小时，进水自由。脱臼处死，75%乙醇中浸泡5min.在超净台中取出肾，置于冷的含双抗的PBS溶液中，去除肾蒂和包膜，将肾皮质剪碎大小至1mm3,PBS洗涤3次后，放置80目不锈钢筛网上，用50ml灭菌注射器柄轻轻研磨，PBS液充分清洗后的网下液转移至100目不锈钢筛网中，将100目筛网倒置PBS冲洗取网上液。　　取得的液体经1500r/min离心8min,弃去上清液在沉淀中加入Ⅰ型胶原酶，分别37℃[键入文字][键入文字][键入文字]精选公文范文管理资料振荡消化，振荡消化时间

4、分三组，分别为20min,25min,30min.双倍体积DMEM-F12培养基中和后，1500r/min离心8min.　　1.3.2肾小管上皮细胞的原代培养及传代　　在上述离心后的沉淀中加入含10%胎牛血清的DMEM-F12培养基，轻轻吹打混匀。接种到25mL培养瓶中。培养瓶静置于37℃5%的CO2培养箱中培养。24h后补加培养基。72h后首次换液。之后隔天换液。原代培养4~6天，细胞贴满瓶底，用胰蛋白酶消化并传代培养。　　1.3.3首次换液后废液的有效利用　　72h首次换液时，将废液至于新的培养瓶中，添加适当的培

5、养基，静置于37℃5%的CO2培养箱中培养。视细胞贴壁状态可于48h半换液，72h全换液。　　1.3.4肾小管上皮细胞的鉴定1.3.4.1倒置显微镜下对细胞的形态及生长进行观察1.3.4.2免疫细胞化学法（SABC法）细胞爬片后，PBS轻轻冲洗。4%多聚甲醛固定[键入文字][键入文字][键入文字]精选公文范文管理资料60min.　　吸去多聚甲醛后空气干燥5min,加入30%H2O2纯甲醇（1:50）混合液浸泡30min,灭活内源性过氧化物酶，PBS冲洗；加5%BSA封闭液，室温条件20min,吸去多余液体；加兔抗人角

6、蛋白CK18（1:200），PBS作为阴性对照。37℃下孵育1h,PBS洗涤3次。加入生物素化山羊抗兔IgG（博士德生物）室温20min,PBS洗涤3次，加SABC37℃反应20min,洗片，使用DAB试剂盒（AR1002）显色，苏木素轻度复染，中性树胶封片。　　2结果　　2.1SD大鼠和昆明小鼠肾小管上皮细胞分离生长和传代的比较　　SD大鼠刚分离的以肾小管节段以及单个游离肾小管上皮细胞，在倒置显微镜下圆形透亮，体积较大，强折光性好。（图1）12h后部分细胞开始贴壁，以肾小管节段周围聚集密集。24h后细胞大量贴壁且有

7、少量上皮样细胞爬出，72h细胞紧密衔接呈典型鹅卵石铺路样，折光性好。（图2）SD[键入文字][键入文字][键入文字]精选公文范文管理资料大鼠传代至第二代时开始有细胞漂浮，传代到第三代时大量凋亡。昆明小鼠刚分离的肾小管以肾小管节段居多，形态与大鼠相似。（图3）贴壁速度比SD大鼠略慢，但生长速度快，培养72h已长满瓶底。（图4）传代至第三代时依旧有大量细胞紧贴瓶底。　　2.2胶原蛋白不同时间的消化结果　　SD大鼠分离出的100目网上液，37℃环境下，胶原酶消化20min肾小管节段较多，于36h已开始贴壁，72h后贴壁达4

8、5%,生长状态较好，纯度较高。细胞传代至第二代细胞活性降低，细胞开始凋亡漂浮。胶原酶消化25min肾小管节段以及游离细胞明显增多，24h有部分细胞贴壁，原代培养36-72h有上皮细胞从周边长出呈岛屿状，（图5）细胞传代到第三代开始有少量细胞漂浮，生长缓慢。胶原酶消化30min游离肾小管上皮细胞居多，贴壁生长均缓慢。传代到第二代细胞呈老化状态。