percoll法分离培养肾小管上皮细胞论文

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1、Percoll法分离培养肾小管上皮细胞论文.freelethodforratrenalproximaltubulecells（RTECs）.MethodsThekidneysofyoungSDratented.Thebredcellsmu-nocytochemistryandtransmissionelectronmicroscopy.ResultsAfter4-5days，theculturedcellsreachedalmostpleteconfluence，displayingthetypicalcobblestonelayou

2、t.Accordingtotheresultsofcellmorphologyandimmunocytochemistry，thepurityofsecondaryculturedrenaltubularepithelialcellsreached98%.ConclusionTheRTECsdissociatedbyPercollgradientcentrifugation，ogeneousharvest，offeringamodel，simulatingtheRTECsinvivo，forphysiologicalandpharma

3、cologicalstudies.Keyalrenaltubularepithelialcell;cellculture;centrifugation;densitygradient近年来，在对各种肾缺血性损伤导致肾衰的研究中发现，尽管缺血性肾衰的发展有多种因素并可分为数个进展阶段，但是肾小管细胞的损伤是其最终促成因素［1］。大鼠肾的亚细胞部分也在一般情况下被用来进行各种肾药物的代谢及免疫组化的研究［2］。因此，本研究旨在通过建立良好的肾小管细胞培养模型，为研究肾小管细胞的缺血、缺氧及各种中毒性损伤等的发病机制、治疗药物筛选提供一个良

4、好的实验平台。1材料和方法1.1材料SD大鼠3只，雌雄不拘，体重（50±10）g，由徐州医学院实验动物中心提供。细胞培养液DMEM.F12（1∶1）液（美国Hyclone公司），添加1.2g.L碳酸氢钠，Ⅰ型胶原酶购自Sigma公司，新生牛血清购自杭州四季青公司，青.链酶素购自华北制药，Percoll细胞分离液购自美国Pharmica公司，胰蛋白酶（美国Sigma公司，国内分装），乙二胺四乙酸盐（EDTA）国产分析纯，GL20C超速冷冻离心机（武汉仪器厂），倒置相差显微镜（日本Olympus产品），抗细胞角质素抗体（cytoterat

5、in18）、链霉亲和素-生物素-过氧化物酶（SABC）即用型试剂盒购自武汉博士德公司，联苯胺（DAB）显色试剂盒购自北京中山公司。1.2方法1.2.1肾小管节段的分离大鼠实验前4h禁食禁水，以10%水合氯醛3.5ml.kg腹腔注射麻醉大鼠后无菌取肾，将其置入含有双抗的4℃生理盐水培养皿中，去除肾包膜，冰上操作，分离剪碎肾皮质约1mm大小，用生理盐水反复冲洗3次后，将其转移至含有0.25%血清、1g.LⅠ型胶原酶的DMEM.F12溶液中，37℃震荡消化20min，用移液管轻轻吹打15～20次，然后将尚未消化的肾皮质更换到新的胶原酶溶液中

6、，继续震荡消化20min，再次吹打15～20次，将2次消化后的细胞悬液经100目不锈钢筛网过滤，并用玻璃棒轻轻研磨同时以生理盐水冲洗，取网下液体经200目筛网过滤后将其转移到离心管中，900r.min离心6min。离心后弃上清，将细胞沉淀用DMEM.F12制成4ml细胞悬液，取预先配制好的45%的Percoll分离液，将细胞悬液轻轻铺于其上，用GL20C超速冷冻离心机离心（13000r.min，4℃，30min），离心后取近管底的F2层，即为分离纯化的近端肾小管细胞节段（图1）。将分离纯化的肾小管细胞节段用生理盐水离心洗涤，1000r

7、.min，10min，洗涤2次。图1Percoll法分离的肾小管细胞节段（×100）（略）1.2.2细胞的原代培养及传代向上述细胞沉淀中加入含10%小牛血清的DMEM.F12培养液，吹打混匀后，接种到50ml玻璃培养瓶内，置入37℃、5%CO2培养箱内孵育，1.5h后将培养瓶中的细胞悬液转移到25ml塑料培养瓶中，用细胞计数板调整肾小管细胞节段密度为5×105，24h后再补1～2ml培养基，72h左右首次换液。之后每2天换液1次。原代培养4～5天，肾小管上皮细胞基本达到90%的融合。倾空瓶内培养液，用生理盐水洗涤细胞2遍，然后向培养瓶

8、内加入0.25%胰酶-0.02%EDTA复合液约1.5ml，充分晃动培养瓶，使消化液覆盖整个细胞面，在倒置相差显微镜下观察1～2min，见瓶内大部分细胞收缩变圆，立即返回操作台内，将消化液倾倒出，然后盖上瓶盖，将其放入3