新生家兔空肠上皮细胞的体外分离培养与鉴定-论文.pdf

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1、动物营养学报2014，26(6)：1570—1578ChineseJournalofAnimalNutritiondoi：10．3969／j．issn．1006-267x．2014．06．018新生家兔空肠上皮细胞的体外分离培养与鉴定范斌余冰’。田刚，张凯。刘汉中。(1．四川农业大学动物营养研究所，成都611130；2．~tJll农业大学动物抗病营养教育部重点实验室，成都611130；3．四川省草原科学研究院，成都611743)摘要：本试验旨在建立家兔空肠上皮细胞的体外分离培养方法，为进一步研究外

2、源物质对家兔小肠上皮结构功能的影响及其作用机制提供体外模型。试验以新生新西兰白兔(1～3日龄)空肠为研究对象，利用由链霉蛋白酶E、胶原酶Ⅳ和二硫苏糖醇组成的混合消化液消化空肠组织，通过2％山梨醇密度梯度离心来富集隐窝细胞团。运用相差消化法和差速贴壁法纯化家兔空肠上皮细胞，并从形态学观察、碱性磷酸酶染色、细胞角蛋白8免疫荧光染色和肠上皮细胞标志物基因表达分析4个方面鉴定家兔空肠上皮细胞。结果表明：应用链霉蛋白酶E、胶原酶Ⅳ和二硫苏糖醇混合消化液可获得大量的细胞团，细胞团12h贴壁并向周围辐射生长，生

3、长的细胞呈典型的三角形或多角形，5～7d融合成片，呈单层生长、互不重叠；原代细胞能够进行传代、纯化；经碱性磷酸酶染色和细胞角蛋白8免疫荧光染色均呈阳性；可表达肠上皮细胞标志蛋白(脂肪酸结合蛋白2、肠肽酶、E一钙黏蛋白、紧密连接蛋白一4)的基因。以上结果表明，本试验成功建立了家兔空肠上皮细胞的体外分离培养方法。关键词：新西兰白兔；空肠上皮细胞；原代培养；鉴定中图分类号：Q813．1文献标识码：A文章编号：1006—267X(2014)06—1570—09肠道既是营养物质消化吸收的主要部位，又系或来源

4、于肿瘤组织，或经过永生化处理(正常细是大多数有毒有害物质侵入机体的主要门户，因胞)，或已传代数十次，其生物性状已与体内正常此，肠道结构和功能的完整性与整个动物机体的细胞相差甚远。癌细胞系甚至在细胞基本结构、健康状况密切相关。肠道由若干层组成，其中黏代谢和功能特性等方面均与正常上皮细胞存在一膜上皮、黏膜固有层、糖萼和分泌的黏液共同构成定的差异，而原代培养的肠上皮细胞其生物性状了肠道屏障¨J。而肠上皮细胞作为黏膜上皮的尚未发生改变，与体内正常细胞接近J。因此，建主要功能性细胞和肠道屏障的主要结构基础，

5、其立可靠且稳定的肠上皮细胞分离培养方法，获得结构功能的完整性对肠道生理功能的正常发挥至纯化的上皮细胞，在一定细胞周期内作为细胞模关重要。型，在肠生理学、肠营养学、肠病理学等研究中具肠上皮结构功能的研究常以体外培养的肠上有重要意义。皮细胞为模型。然而，这些研究多采用细胞系进目前，已在体外成功分离培养了人、家行，如大鼠隐窝细胞系(IEC．6／一18)，人结肠腺癌禽I9]、鼠o-]、猪”。。、牛和羊等物种细胞系(Caco一2和HT一29)，人正常小肠细胞系的小肠上皮细胞。然而，国内外有关家兔肠细胞(HI

6、EC一6、H4、H4—1)，新生仔猪小肠上皮细胞系分离培养的研究较少，且主要集中于结肠上皮细(IPEC—J2、IPEC—l、PSI一1／CLAB)等。这些细胞胞，有关小肠上皮细胞的报道很少。。鉴收稿日期：2013—12—13基金项目：四川省科技计划项目“家兔现代产业链关键技术研究与集成示范”(2012NZ0005)；四川农业大学“双支计划”项目作者简介：范斌(1988一)，江西宜春人，硕士研究生，从事饲料资源开发与高效利用研究。E—mail：fanbin～sicau@163．tom通讯作者：田刚，

7、副教授，硕士生导师，E—mail：tgang2008@126．com6期范斌等：新生家兔空肠上皮细胞的体外分离培养与鉴定于小肠在组织学上可分为十二指肠、空肠(占小肠1．2试验方法长度的近90％)和回肠J，且各肠段的生理功能不1．2．1试剂配制尽相同，因此，分离培养特定肠段的黏膜上皮细胞DMEM／F12完全培养基：由DMEM／F12培养对研究肠上皮的结构功能似乎更为合理，且更有基中添加5％胎牛血清、20ng／mL表皮生长因子、说服力。Brow等报道了用透明质酸酶消化家l％ITS．A、100ixg／m

8、L肝素钠、1％青链霉素混合兔空肠而分离出有活性的肠细胞，从蔗糖酶和一液组成；肠组织清洗液：含1．25~g／mL两性霉素谷氨酰转移酶的活性分析指出分离的细胞来源于B、25ixg／mL氨苄西林和2％青链霉素混合液的磷上端绒毛，但未对细胞进行传代、纯化。因此，本酸盐缓冲液(PBS，pH=7．2—7．4)，一次性针头滤试验拟以新生新西兰白兔(1—3日龄)空肠为研究器过滤除菌；混合酶消化液：由0．5mg／mL链霉蛋对象，采用链霉蛋白酶E、胶原酶Ⅳ和二硫苏糖醇白酶E、0．2mg／mL胶原酶Ⅳ和