血管紧张素ⅱ诱导肾小管上皮细胞损伤的实验研究

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1、血管紧张素Ⅱ诱导肾小管上皮细胞损伤的实验研究作者：张建鄂,罗昌霞,张庆红,李涛　[摘要]目的:研究血管紧张素Ⅱ诱导肾小管上皮细胞损伤的机制。方法:血管紧张素Ⅱ（10-7μmol/l）加入肾小管上皮细胞为对照组；体外培养的肾小管上皮细胞作为空白对照；不同浓度缬沙坦（10-6μmol/l、10-7μmol/l、10-8μmol/l、10-9μmol/l）先与肾小管上皮细胞共同培养半小时后再加入血管紧张素Ⅱ（10-7μmol/l）为干预组；EMSA、RT-PCR分别检测不同时限NF-κB活性、骨桥蛋白mRNA表达。结果:血管紧张素Ⅱ可诱导肾小管上皮细胞

2、内NF-κB活性增加，骨桥蛋白mRNA表达上调；而不同浓度缬沙坦干预组检测结果显示NF-κB活性、骨桥蛋白mRNA表达明显下调。结论:血管紧张素Ⅱ诱导肾小管上皮细胞损伤与导致肾小管上皮细胞内NF-κB活性增加、骨桥蛋白mRNA转录上调有关。这一过程可能依赖血管紧张素ⅡⅠ型受体。　　[关键词]血管紧张素Ⅱ;肾小管上皮细胞;核转录因子-κB;骨桥蛋白　　Abstract：ObjectiveToexplorethemechanismofangiotensinⅡinducingtheinjuryofproximaltubularcells.Methods

3、Culturedcellsol/l）asthecontrol;culturedcellsol/l）astheinterventiongroup;proximaltubularcellsulationasblankcontrol;EMSA,RT-PCRRNAexpressionindifferentperiods,respectively.ResultsAngiotensinⅡcouldincreaseNF-κBactivityandupregulateOPNmRNAexpressioninproximaltubularcells.SA试剂盒（pr

4、omega公司）；血管紧张素Ⅱ（sigma公司）；RT-PCR试剂盒（BDBioscience公司）；TRIZOL（GiBco公司）；RNaseA抑制剂（Novagen公司）；引物（上海生工生物工程技术公司）；大鼠的肾小管上皮细胞株(NRK细胞)购至中科院上海细胞库；冷冻离心机（Biofuge公司），二氧化碳温箱（Formascientific公司）。缬沙坦由北京诺华公司提供。　　1.2细胞培养无菌条件下大鼠肾小管上皮细胞株，0.25%胰酶消化2min，观察细胞分散成拉网状，终止消化，加入RPMI1640培养液（含20%胎牛血清，300mg/l谷

5、氨酰胺、青霉素、链霉素）反复吹打，并分装至培养皿，置于37℃二氧化碳温箱中孵育；反复传代，取第七代细胞实验用。　　1.3实验分组当传代细胞长至90%融合时换无血清培养液继续培养12h。试验分组如下：①空白对照:未加刺激物的培养细胞。②对照组:血管紧张素Ⅱ（10-7μmol/l）加入培养细胞，分别于12、24h检测NF-κB活性；12、24h检测骨桥蛋白mRNA表达水平；每个检测指标均设五个重复组。③干预组:不同浓度缬沙坦（10-6μmol/l、10-7μmol/l、10-8μmol/l、10-9μmol/l）加入培养细胞，半小时后再加入血管紧张素

6、Ⅱ（10-7μmol/l），分别于12h检测NF-κB活性；12h检测骨桥蛋白mRNA表达水平；每个检测指标均设五个重复组。　　1.4EMSA的操作步骤①核蛋白的提取Bradford法定量。②EMSA的操作依试剂盒说明书（Cat#3050）进行NF-κB寡核苷酸探针[r-32p]ATP标记及EMSA法测定NF-κB活性。NF-κB同序寡核苷酸探针序列为3′-TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG5′；5′-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3′。反应结束后，在4%非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳2h（电压150V，电泳缓冲液为0.5×

7、TBE）。电泳完毕后干胶，-70℃放射自显影。电泳结果经密度扫描仪进行半定量分析。　　1.5骨桥蛋白的RT-PCR操作步骤培养细胞接种至12孔培养板，当细胞长至80%～90%融合时换无血清培养液，12h后按试验分组加药物干预，每组细胞均设五个复孔。①TRIZOL提取总RNA，并测定浓度及260/280nm的吸光度（A）值。②按T1TANIUMTMone-stepRT-PCR试剂盒说明进行操作。反应条件：50℃1h，90℃5min；94℃30′，65℃30′，68℃1min30个循环；68℃延伸2min，4℃保存。骨桥蛋白上游引物序列：5′AAGC

8、CTGACCCATCTCAGAA3′；骨桥蛋白下游引物序列为：5′GCAACTGGGATGACCTTGAT3′，产物长度446bp；设β