乙型肝炎病毒对肾小管上皮细胞直接作用的实验研究

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1、乙型肝炎病毒对肾小管上皮细胞直接作用的实验研究【摘要】目的:探讨乙型肝炎病毒（HBV）在体外对人肾小管上皮细胞（HKC）的直接致病作用。方法:①HBV体外感染HKC：培养的HKC传至6孔板中，接种密度为1×106个/ml，孵育24h后分受感染和阴性对照两组。受感染组加入0.5mlHepG2.2.15细胞上清液（含有HBV）；阴性对照组加入0.5ml10%FCS-DMEM/F-12培养液。两组HKC继续孵育72h，消化，离心沉淀，PBS清洗，实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测两组HKC中的HBVDNA含量。②HBV对

2、体外培养的HKC细胞直接作用：HKC细胞传至24孔板中，接种密度为1×105个/ml，受感染组分三个亚组，分别加入100μl、200μl和300μl的感染用HepG2.2.15细胞上清液；阴性对照组为接种HKC后加入培养液常规培养；阳性对照组为HepG2.2.15细胞上清液。各组的每孔终体积均为2ml，每组设3复孔。孵育72h后收集各孔上清液，ELISA法检测转化生长因子β1（TGF-β1）的表达。结果:①受感染组HKC的基因组中检测到HBVDNA。②受感染组的三个亚组细胞培养上清的TGF-β1与阴性对照组比较差异均有显著性

3、。结论:HBV可感染HKC并促进其分泌TGF-β1。【关键词】细胞培养技术；肝炎病毒，乙型；感染；HepG2.2.15细胞Abstract:Objective:ToinvestigatethedirectpathogeniceffectsofHepatitisBvirus（HBV）onhumantubularkidneycells(HKCs)invitro.Methods:HKCsl.24hourslater，HKCslsupernatantofHepG2.2.15cells,l10%FCS-DMEM/F-12ovedand

4、thenerasechainreaction(FQ-PCR).DirectpathogeniceffectsofHBVonHKCs:HKCsl.Negativecontrolgroup,positivecontrolgroupandinfectedgroupeacheofHKC.IntheHKC,persistentinfectionofHBVenhancedtheexpressionoftransforminggroantubularepithelialcellissusceptibletoHBVandHBVinfecti

5、oncanenhancetheexpressionofTGF-β1.KeylG418、100IU/ml青霉素和链霉素及以5%NaHCO3调pH至7.0～7.2的DMEM培养基，在5%CO2孵育箱37℃培养，细胞呈铺路石样贴壁生长，3～5d换液一次。当长至约80%融合时，予以传代。1.2.2HKC的培养：自武汉大学中国典型培养物保藏中心购取已贴壁生长的HKC，用10%FCS-DMEM/F-12培养基培养，以5%NaHCO3调pH至7.0～7.2。在培养基加入100IU/ml青霉素、链霉素、0.238%Hepes(pH7.0)和

6、0.3%谷氨酰胺，在5%CO2孵育箱37℃培养。细胞呈上皮样贴壁生长，3d换液一次。当长至约80%融合时，予以传代。1.2.3感染用HepG2.2.15细胞上清液的制备：将HepG2.2.15细胞培养至约80%融合时，吸去培养瓶中的培养液并加入胰酶，吸取的培养液离心后留取上清，-70℃保存备用，称之为“阳性对照用HepG2.2.15细胞上清液”。从中收集经胰酶消化的HepG2.2.15细胞，制备成单细胞悬液，-70℃保存备用；然后将备用的冻存单细胞悬液反复冻融两个循环，离心后取上清，用于感染肾小管上皮细胞实验，称之为“感染用

7、HepG2.2.15细胞上清液”。1.2.4HBV感染肾小管上皮细胞：将HKC传代至6孔板，接种密度为1×106个/ml，24h后进行HBV感染实验。实验分组:①受感染组：往孔板中加入制备好的感染用HepG2.2.15细胞上清液0.5ml。②阴性对照组：加入0.5ml10%FCS-DMEM/F-12培养液。每组终体积均为2.0ml。两组HKC继续孵育72h后，0.25%胰蛋白酶+0.05%EDTA消化，吹打成单细胞悬液，离心，取沉淀，以PBS溶解后离心，反复洗3次后以200μlPBS溶解沉淀，同时吸取受感染组第3次洗液以备D

8、NA提取后HBVDNA的检测。1.2.5ELISA法检测TGF-β1：将HKC培养至第3天，换液1次，待细胞生长至80%融合时传代并接种于96孔培养板，接种密度为1×105个/ml。实验分组：①受感染组各亚组：接种HKC后按加入感染用HepG2.2.15细胞培养上清液的体积分为3个亚组（体