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1、细胞凋亡论文：游离脂肪酸诱导肾小管上皮细胞凋亡的实验研究[摘要]目的探讨游离脂肪酸(FFAs)对大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK-52E)的凋亡作用及凋亡机制。方法用含有不同浓度(0、125、250、500μM)软脂酸的DMEM-F12培养肾小管上皮细胞(NRK-52E),在24h、48h两个时段以原位末端标记(TUNEL法)检测细胞凋亡率,用硝酸还原酶法测定以上各组培养液中一氧化氮(NO)水平。在48h时段用免疫细胞化学法检测caspase-3表达水平。结果随着软脂酸浓度的增高、作用时间的延长:①NRK-52E细胞的凋亡率逐渐增高,24h时三个软脂酸组按软脂酸浓度由低到高的凋
2、亡率依次为(9.7±1.9)%、(14.2±4.5)%、(23.4±5.3)%,48h时为(16.2±3.7)%、(24.8±4.4)%、(35.4±5.7)%,与对照组相比均有统计学意义(P<0.05);②在凋亡率增高组的培养液中测得NO浓度也增加,差异均有显著性(P<0.05)。③48h时各软脂酸干预组caspase-3阳性表达率增高,与对照组相比均有统计学差异(P<0.05)。结论游离脂肪酸具有促进肾小管上皮细胞凋亡的作用,而这种作用与其自身在FFAs作用下产生过多的NO使caspase-3高表达有关。 [关键词]游离脂肪酸;近端肾小管上皮细胞;一氧化氮;凋亡;cas
3、pase-3糖尿病肾病(diabeticnephropathy,DN)是高发的糖尿病慢性并发症,糖尿病终末期肾病占到所有终末期肾病的30%以上,细胞凋亡在肾脏疾病的发生、发展过程中发挥着极其重要的作用。2型糖尿病常伴血脂代谢紊乱,血清游离脂肪酸浓度随着血糖的异常发生改变,伴随空腹血糖水平的升高而升高[1]。FFA异常增多可诱导多种细胞凋亡,本实验正是观察不同浓度的软脂酸对大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK-52E)凋亡及凋亡信号蛋白caspase-3的影响,探讨FFAs导致肾小管上皮细胞凋亡的机制。 1材料和方法 1.1材料 大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK-52E)由中山大
4、学余学清教授惠赠,软脂酸、EMDE-F12培养基购于Gibco公司,新生胎牛血清购于杭州四季青生物公司;去脂牛血清白蛋白(d-BSA);NO检测试剂盒购自南京建成公司,凋亡试剂盒、DAB显色剂、caspase-3多克隆抗体(浓度为1∶150)及生物素化羊抗兔IgG及均购自博士德公司。 1.2方法 1.2.1细胞培养采用含10%胎牛血清的DMEM-F12为NRK-52E细胞的培养液,在含5%CO2浓度37℃恒温培养箱内孵育,细胞传至第四代处于生长对数期时进行下述实验,每个实验重复3次。1.2.2分组方法实验共设立五组(1)软脂酸干预组设三组:以去脂牛血清白蛋白(d-BSA)
5、为溶解软脂酸的载体,以加入培养液中软脂酸浓度的不同分为125μmol/L、250μmol/L、500μmol/L,(各组载体d-BSA含量为0.125%、0.25%、0.5%);(2)对照组设两组:①正常培养液组②0.5%d-BSA+正常培养液组。 1.2.3硝酸还原酶法分别测定NO常规消化、收集NRK-52E细胞,按每孔1×105接种于6孔培养板内,置37℃、5%CO2培养24h,换无血清培养液培养24h同步化细胞,加入不同浓度软脂酸继续培养,在0h、24h、48h时收集细胞培养液各100μL,-20℃储存用硝酸还原酶法测定各组NO含量。 1.2.4原位末端标记(TUN
6、EL法)检测细胞凋亡水平按每孔1×105接种于放有盖玻片的6孔培养板内,置37℃、5%CO2孵箱细胞爬片培养24h,换无血清培养液培养24h同步化细胞后,加入不同浓度软脂酸继续培养,分别在24h、48h进行实验:先用PBS洗涤2次,加入4%多聚甲醛室温下固定30min,按照tunel凋亡检测说明书操作。再用苏木素轻度复染正常细胞,凋亡的细胞胞质浓缩、胞核固缩呈黄色,正常细胞形态正常胞核呈蓝色。从而可以在显微镜下观察到着色的凋亡细胞。在400倍倒置显微镜下计数,凋亡率=凋亡细胞数/400倍视野中细胞总数×100%,每张片随机取9个视野,每个实验组观察5张片。 1.2.5免疫细
7、胞化学法检测caspase-3按每孔1×105接种于放有盖玻片的6孔培养板内,置37℃、5%CO2孵箱细胞爬片培养24h,换无血清培养液培养24h同步化细胞后,加入不同浓度软脂酸继续培养,在48h进行实验:先用PBS洗涤2次,加入4%多聚甲醛室温下固定30min,PBS洗2次,蒸馏水洗3次,3%H2O2处理5min,蒸馏水洗3次,5%BSA封闭20min,甩去不洗加一抗4℃湿盒过夜,PBS洗3次,加二抗(生物素化羊抗兔IgG)37℃反应20min,PBS洗3次,加SABC37℃反应20min,PBS洗4
