阿魏酸钠对顺铂诱导的肾小管上皮细胞凋亡的影响-论文.pdf

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1、小管上皮细胞凋亡的影响第21·5399·阿魏酸钠对顺铂诱导的肾小管上皮细胞凋亡的影响杨宁李龙凯赵光本方明谢华陈吉林林洪丽(大连医科大学附属第一医院肾内科，辽宁大连116011)[摘要]目的观察阿魏酸钠对顺铂诱导的肾小管上皮细胞凋亡的影响。方法通过流式细胞术和TUNEL法检测细胞凋亡，反转录PCR及免疫组化法分别检测bax、bc1-2的mRNA和蛋白表达。结果(1)25、50、100vmol／L顺铂组的各组间凋亡率比较有差异(P<0．05)。50m01／L顺铂在4、8、12、24h，组间凋亡率比较有差异(P<0．05)；(2)

2、50~xmol／L顺铂作用24h，其凋亡率均较空白对照组显著升高(P

3、小管上皮细胞凋亡具有时间和剂量依赖性，阿魏酸钠可通过上调bcl-2以及下调bax的表达来抑制顺铂诱导的细胞凋亡，从而减少顺铂的肾毒性。[关键词]阿魏酸钠；顺铂；肾小管上皮细胞；bax；bc1-2[中图分类号]R285[文献标识码]A[文章编号]1005-9202(2013)21-5399-03；doi：10．3969／j．issn．1005-9202．2013．21．089顺铂的肾毒性具有时间和剂量依赖性，以线粒体和死亡受处理后，采用250l的结合缓冲液将细胞重新悬浮，并将细体途径激活诱导肾小管上皮细胞发生凋亡0]。阿魏酸钠

4、能够胞悬液的浓度重新调节为1×10个／ml。采用5IIl1流式管收抑制肿瘤坏死因子介导的血管内皮细胞以及过氧化氢介导集上述细胞悬液100l，并加入AnnexinV／FITC5l以及碘化的PC：细胞的凋亡。但是，阿魏酸钠是否对顺铂介导的肾小丙啶(PI)10Ixl，遮光条件下进行15min的孵育，加PBS缓管上皮细胞的凋亡有抑制作用，目前尚无定论。本研究探讨阿冲液400Ixl后，通过流式细胞仪检测细胞凋亡率。魏酸钠对顺铂诱导的肾小管上皮细胞凋亡的抑制机制。1．5TUNEL细胞凋亡检测严格按照TUNEL细胞凋亡检测试剂盒的说明书以

5、及相关的操作流程进行操作。如果细胞核1材料与方法荧光染色为绿色则为阳性结果。1．1材料正常大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK52E细胞)购1．6逆转录PCR检测bcl-2和bax的mRNA表达按照RNA自美国模式培养物集存库。顺铂注射液由Sigma生产，注射用提取试剂盒的操作说明提取RNA，并逆转录为cDNA。逆转录阿魏酸钠由成都第一制药有限公司生产，Annexin—VFITC细胞PCR引物为：bcl-2的上游引物为：5．CTCAGTCATCCACAG凋亡检测试剂盒由深圳晶美生物工程有限公司生产。TUNELGGCGA一3，下游引

6、物为：5一AGAGGGGCTACGAGTGGGAT．细胞凋亡检测试剂盒由罗氏公司生产，兔抗大鼠Bax单克隆抗3；bax的上游引物为：5一ACAAAGATGGTCACGGTCTGCC．体以及兔抗大鼠bc1-2单克隆抗体均由北京中山生物技术有限3，下游引物为：5．GGTTrcATCCAGGATCGAGACGG-3；13．公司生产，TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver．3．0试剂盒由宝生actin的上游引物为：5-AACCGGGAGAAGATGACCCAG物工程(大连)有限公司生产。ATCATGm’-3，下游引物为：5．

7、GTGAAGCTCGrITI’CTCTAC1．2模型的建立选择浓度为25、5O以及100p~mol／L的顺CGGCGTAGTAGC-3-，将其扩增为450、429以及352bp长度铂作用24h，同时选择50I~mol／L顺铂作用4、8、12、24h作为的cDNA片段。观察NRK52E细胞凋亡率的时间点，采用流式细胞术检测1．7免疫组织化学法测定bax蛋白和bcl-2蛋白表达细胞NRK52E细胞的凋亡率，选择合适的顺铂诱导细胞凋亡的浓度爬片后，采用冷丙酮固定，过氧化氢一甲醇溶液处理、PBS缓冲液和时间，建立顺铂诱导的细胞凋亡的

8、损伤模型。冲洗以及羊血清封闭后，将30l的1：100的兔抗大鼠bax单1．3实验分组设立6个实验组，空白对照组：正常培养的肾克隆抗体及兔抗大鼠bcl-2单克隆抗体加入并4qC孵育过夜，再小管上皮细胞；顺铂组：50moL／L顺铂；阿魏酸钠组：100、250、加入生物素标记的羊抗兔IgG孵育，