nfκb介导促红细胞生成素神经细胞保护作用的研究

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1、NFκB介导促红细胞生成素神经细胞保护作用的研究作者：董文斌,侯红梅,王琼,陈枫,航永伦【摘要】　　目的:观察促红细胞生成素(EPO)对谷氨酸（Glu）诱导的大脑皮质神经元损伤的保护作用和核因子κB(NFκB)介导的细胞内信号转导机制。方法:采用1日龄Wistar大鼠皮层神经细胞体外原代培养技术,建立Glu兴奋性毒性神经细胞损伤模型。实验分为正常对照组、Glu组、EPO组和吡咯烷二硫氨基甲酸（PDTC,NFκB活化阻断剂）组。倒置显微镜下观察细胞的形态学改变;MTT法测定细胞存活率;流式细胞术测定细胞凋亡率评价细胞损伤程度。结果:Glu处理后神经细胞形态明显受损,

2、EPO组神经细胞形态趋于正常,PDTC组细胞形态与Glu组相似;与正常对照组相比,Glu组神经细胞存活率明显下降、凋亡率明显升高,差异均有统计学意义（P<0.01）;而与Glu组相比,EPO组神经细胞存活率明显增高下降、凋亡率明显下降,差异均有统计学意义（P<0.01）。与EPO组相比,PDTC组细胞存活率明显下降、凋亡率明显升高,差异均有统计学意义（P<0.01）,这些变化与Glu组相似。结论:EPO对Glu诱导的大脑皮质神经元损伤的具有保护作用,其胞内信号转导机制涉及到NFκB的活化。【关键词】促红细胞生成素谷氨酸神经元核因子κB信号9传导　　新生

3、儿缺氧缺血性脑病（hypoxicischemicencephalopathy,HIE）是导致儿童伤残的重要疾病之一。谷氨酸(glutamate,Glu)的大量释放是其神经细胞损伤的主要原因［1］。研究显示:促红细胞生成素(erythropoitin,EPO)对Glu诱导的神经细胞损伤具保护作用［2,3］,其胞内信号机制尚不清楚,国外研究认为核因子κB(NFκB)活化介导其信号传导过程［3,4］。本研究在前期工作的基础上［1,3］,进一步从NFκB活化途径探讨EPO对Glu诱导的神经毒性的保护机制。　　1材料和方法　　1.1材料Wistar新生大鼠(1日龄)由泸州医

4、学院标准动物科提供;NeurobasalMedium（NM）,B27系Gibco公司产品;Glu,RPMI1640,四甲基偶氮唑盐（MTT）均购于Sigma公司;小牛血清系成都美特科技有限公司产品;EPO购于成都地奥制药公司;四氢吡咯烷二硫氨基甲酸酯（PDTC）为Sigma公司产品;AnnexinVFITC凋亡检测试剂盒购于达克为生物技术有限公司;流式细胞仪(Epics型)为CoulterCompany产品;倒置显微镜(XSJD型)为Olympus产品。　　1.2方法9　　1.2.1大脑皮层神经细胞原代培养取1日龄的新生大鼠,碘酒和750mL/L的乙醇消毒皮肤后取双侧

5、大脑皮质,剔除软脑膜和血管。Hank’s液冲洗2遍。终浓度1.25g/L胰蛋白酶常温下消化5min,1000r/min离心10min,弃上清,用含100mL/L小牛血清的RPMI1640悬浮混匀,制成1×106/L密度的细胞悬液。接种于96孔培养板（100μL/孔）,24孔培养板（1mL/孔）,35mm培养皿中（2mL/皿）。置37℃、50mL/LCO2培养箱中,24h后换无血清培养液,成分为NM49%（V/V）、RPMI164049%（V/V）、2%B27（V/V）。每3d半量换液1次,培养8d。　　1.2.2实验分组上述培养8d的皮层神经细胞作如下分组:（1）正常对照

6、组:不加Glu,余处理相同;（2）Glu组:加入含Glu的无血清培养液（Glu终浓度200μmoL/L）,作用30min,Hank’s冲洗2遍后,换新鲜培养液,继续培养24h;（3）EPO处理组:加入Glu前24h加入最佳干预终浓度为30pmol/L的EPO;（4）PDTC组:最佳干预终浓度EPO作用24h后加入含0.1mmol/LPDTC的无血清培养基孵育30min,余处理同EPO组。　　1.2.3实验指标的检测在倒置显微镜下观察神经细胞的形态学变化。MTT法测定神经细胞存活率:Glu作用30min后换新鲜培养液继续培养24h,取96孔培养板,每孔加入MTT溶液（5μg

7、/L）20μ9L,37℃继续培养4h,终止培养,小心吸弃上清,每孔加入150μL二甲亚枫（DMSO）,震荡15min使沉淀充分溶解。在微孔酶标仪在490nm处测定其光吸收值。存活率用百分率表示,对照组为100%。流式细胞术检测细胞凋亡率:Glu作用30min后换新鲜培养液,继续培养24h,将每皿的细胞消化、离心、收集于离心管中,制成单细胞悬液,按凋亡试剂盒要求,加入500μLBuffer液,振荡摇匀。再加入5μLAnnexinⅤ和5μLPI液,冰上避光反应5min,在流式细胞仪上检测神经细胞凋亡率。　　1.2.4统计学处理细胞