microRNA 30c介导的NF-κB通路在神经母细胞瘤增殖及转移中的作用及机制研究.pdf

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1、分类号：R72密级：公开学校代码：11065学号：2014010034学术博士学位论文microRNA30c介导的NF-κB通路在神经母细胞瘤增殖及转移中的作用及机制研究作者姓名江晨指导教师董蒨教授学科儿科学培养单位医学部儿科学系答辩日期2018年05月23日microRNA30c介导的NF-kB通路在神经母细胞瘤增殖及转移中的作用及机制研究摘要背景神经母细胞瘤（NB）是婴幼儿最常见的恶性肿瘤之一，早期转移是该肿瘤患儿死亡的主要原因，探明NB转移的分子生物学机制始终是此肿瘤研究领域的焦点方向。已有研究表明，NF-κB通路和miRNAs均是NB增

2、殖和转移的重要调控方式，而miRNAs又是众多参与NF-κB通路调节的因子之一。迄今，miRNAs介导NF-κB通路调控NB增殖和转移的研究鲜有报道。我们既往的研究已证实：miR30c在神经母细胞瘤中显著低表达，其预测靶基因IL-1A又正是NF-κB信号转导通路的重要活化因子，所以我们从miR30c着手，以期查明miR30c是否调节IL-1A进而通过NF-κB通路调控NB增殖和转移，并探讨其具体机制，探索NB临床治疗和靶向药物开发的新方向。方法①应用实时定量PCR技术，检测16对神经母细胞瘤原位组织和远处转移组织中miR30c的表达水平；②mi

3、croRNA30c对神经母细胞瘤细胞系SHSY5Y及GI-Li-N生物学行为研究，分组：miRNA-NC组、miR30cmimics组、ASO-NC组、miR30cASO组。在神经母细胞瘤细胞系SHSY5Y和GI-Li-N中瞬时转染miR30cmimics和miR30cASO，采用平板克隆形成实验、AnnexinV-PI双标流式实验、肿瘤细胞侵袭实验和体外划痕实验检测miR30c对细胞生长、侵袭和迁移的影响，利用Western蛋白免疫印迹法检测miR30c对SHSY5Y和GI-Li-N细胞IL-1A蛋白表达水平的影响；③EGFP实验验证micr

4、oRNA30c直接靶定IL-1A，分组：miR30cmimics+IL-1A3’UTR组（miR30cmimics与IL-1A野生型序列共转染）、miR30cmimics+IL-1A3’UTRmut组（miR30cmimics与IL-1A突变型序列共转染）、miR30cmimicsNC+IL-1A3’UTR组（miR30cmimicsNC与IL-1A野生型序列共转染）和miR30cmimicsNC+IL-1A3’UTRmut组（miR30cmimicsNC与IL-1A突变型序列共转染）。构建IL-1A野生型及突变型3’UTR区并测序，构建含IL

5、-1A与miR30c结合位点序列（野生型）及其结合位点突变序列（突变型）的EGFP报告载体，检测miR30cmimics与IL-1A野生型序列共转染后，SHSY5Y和GI-Li-N细胞相对EGFP荧光强度的变化；④采用siRNA技术敲降IL-1A，分组：siRNAcontrol组和siRNAIL-1A组，采用平板克隆形成实验、AnnexinV-PI双标流式实验、肿瘤细胞侵袭实验和体外划痕实验检测敲降IL-1A对细胞生长、侵袭和迁移的影响，利用Western蛋白免疫印迹法检测敲降IL-1A对SHSY5Y和GI-Li-N细胞IL-1A和AKT蛋白表

6、达水I平的影响；⑤挽救实验验证miR30c是通过靶定IL-1A发挥细胞生物学功能，在神经母细胞瘤细胞系SHSY5Y和GI-Li-N中瞬时共转染miR30cmimics和IL-1A/pcDNA3，分组：mimicscontrol组、miR30cmimics组、miR30cmimics+pcDNA3control组和miR30cmimics+IL-1A/pcDNA3组，荧光定量PCR检测各组miR30c水平、Western蛋白免疫印迹法检测细胞IL-1A、AKT蛋白水平，采用平板克隆形成实验、AnnexinV-PI双标流式实验、肿瘤细胞侵袭实验和体

7、外划痕实验检测共转染miR30cmimics和IL-1A/pcDNA3对细胞生长、侵袭和迁移的影响；⑥NF-κB活性检测：在神经母细胞瘤细胞系SHSY5Y和GI-Li-N中瞬时共转染miR30cmimics和IL-1A/pcDNA3，分组：mimicscontrol组、miR30cmimics组、miR30cmimics+pcDNA3control组和miR30cmimics+IL-1A/pcDNA3组，凝胶迁移实验检测NF-κB活性，免疫荧光检测细胞核p65从而反映NF-κB活性；⑦体内裸鼠实验验证miR30c对体内裸鼠成瘤影响，分组：con

8、trol空白对照组、mimicsNC组和miR30Cmimics组，检测瘤块生长情况、免疫组织化学法检测瘤组织IL-1A表达情况、Western蛋白免