微小RNA7及长链非编码RNA TUG1在神经母细胞瘤增殖、侵袭和转移中的作用及机制研究.pdf

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1、分类号：R73密级：公开UDC：610学校代码：11065博士学位论文微小RNA7及长链非编码RNATUG1在神经母细胞瘤增殖、侵袭和转移中的作用及机制研究张桓瑜指导教师董蒨教授学科专业名称儿科学（小儿外科）论文提交日期2018年4月2日论文答辩日期2018年5月23日答辩委员会主席郑珊教授微小RNA7及长链非编码RNATUG1在神经母细胞瘤增殖、侵袭和转移中的作用及机制研究摘要第一部分微小RNA7对神经母细胞瘤侵袭和转移的作用及其机制研究目的：探寻神经母细胞瘤中微小RNA7（miR-7）表达水平，明确miR-7在神经母细胞瘤中生物学

2、功能并探讨其调控机制。方法：miRNAMicroArray结果发现miR-7在人神经母细胞瘤组织中低表达，利用qRT-PCR验证miRNAMicroArray的结果。利用脂质体分别将miR-7con、miR-7mimics、miR-7inhibitor瞬时转染到人神经母细胞瘤SK-N-SH和SH-SY5Y两种细胞株中，用实时荧光定量PCR检测转染效率。通过细胞黏附实验、woundhealingassay和侵袭小室实验检测人神经母细胞瘤细胞转染miR-7con、miR-7mimics、miR-7inhibitor后体外侵袭和迁移的能力的

3、变化，裸鼠尾静脉注射转移瘤动物模型检测人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y转染miR-7mimics后体内侵袭和迁移的能力。利用生物信息学网站预测miR-7潜在的靶基因，并应用Dual-luciferasegenereportingsystem和蛋白免疫印迹（Westernblot）实验方法对潜在的靶基因进行验证。然后，利用脂质体LipofectamineTM2000分别将si-Scb和CatKsiRNA瞬时转染到神经母细胞瘤SK-N-SH和SH-SY5Y两种细胞系，利用Western-blot检测CatK在各组细胞中的表达水平，用细胞黏

4、附实验、woundhealingassay和侵袭小室实验检测神经母细胞瘤细胞体外侵袭和迁移能力的变化。最后，利用脂质体LipofectamineTM2000分别将pcDNA3.0、pcDNA3.0-Catk、pcDNA3.0-Catk+miRNAcon和pcDNA3.0-Catk+miR-7mimics瞬时转染到人神经母细胞瘤SK-N-SH和SH-SY5Y两种细胞系，利用Western-blot检测CatK在各组细胞中的表达水平，再次用细胞黏附实验、woundhealingassay和侵袭小室实验检测神经母细胞瘤细胞转染后体外侵袭和迁

5、移能力的变化。结果：实时荧光定量PCR显示与原位肿瘤组织相比，miR-7在人神经母细胞瘤转移瘤组织中的表达降低（p<0.01）；人神经母细胞瘤SK-N-SH和SH-SY5Y两种细胞系在转染miR-7con、miR-7mimics或miR-7inhibitor后Real-timePCR检测发现与miR-7con转染组相比，miR-7mimics或miR-7inhibitor转染组中miR-7表达水平相应升高或者降低；在细胞水平上研究发现，与对照组相比神经母细胞瘤细胞中过表1达或下调miR-7后，能够相应的抑制或促进肿瘤细胞的侵袭和转移能

6、力（p<0.01）。在裸鼠体内水平上研究发现，miR-7过表达同样可以抑制SH-SY5Y细胞的侵袭和转移能力(p<0.01)。利用生物信息学方法筛选出CatK可能为miR-7的靶基因，双荧光素酶报告系统结果显示含有CatK3’UTR荧光报告载体的相对荧光值明显降低，含有CatK3’UTR-mut的报告载体的相对荧光值与对照组相比没有影响(p<0.01)。Westernblot结果表明在神经母细胞瘤细胞中过表达miR-7后能够抑制CatK的表达，而转染miR-7inhibitor组细胞中CatK表达水平显著升高(p<0.01)。CatK

7、siRNA下调CatK表达后同样可以抑制肿瘤细胞的侵袭和转移能力，并且pcDNA3.0-CatK与miR-7mimics共转染后能够部分逆转miR-7对肿瘤细胞侵袭和转移的抑制能力(p<0.01)。结论：miR-7在人神经母细胞瘤转移瘤组织中表达下调，CatK是miR-7的直接靶基因，miR-7通过抑制CatK的表达抑制神经母细胞瘤细胞的进展和恶化。博士研究生：张桓瑜（儿科学）指导教师：董蒨（教授）关键词：微小RNA7；神经母细胞瘤；CatK；侵袭；转移2摘要第二部分长链非编码RNATUG1对神经母细胞瘤细胞增殖、侵袭和迁移的影响目的

8、：检测长链非编码RNATUG1（TUG1）在神经母细胞中的表达情况，探讨TUG1在神经母细胞瘤细胞中对增殖、侵袭和转移能力的作用及其机制。方法：收集35对人神经母细胞瘤患者临床标本（神经母细胞瘤组织及瘤旁正常组织），利用