长链非编码RNA CASC2在肺腺癌侵袭迁移中的作用研究.pdf

《长链非编码RNA CASC2在肺腺癌侵袭迁移中的作用研究.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、分类号：R655密级：公开学校代码：11065学号：y0115130110专业博士学位论文长链非编码RNACASC2在肺腺癌侵袭迁移中的作用研究作者姓名王栋指导教师沈毅（主任医师）专业领域外科学（胸外）培养单位医学部临床医学系答辩日期2018年5月16日长链非编码RNACASC2在肺腺癌侵袭迁移中的作用研究摘要肺癌目前是全世界范围内发病率最高的恶性肿瘤，其死亡率居所有肿瘤类型的首位，尽管目前随着临床技术的进展及相关靶向药物的研发，肺癌的治疗发生了翻天覆地的变化，但肺癌的五年生存率仍旧未得到明显改善。肺癌主要分为非小细胞肺癌（80%-85%）及小细胞肺癌（20%左右），其中非小细胞肺癌中以

2、肺腺癌为主要病理类型。随着高通量测序技术的发展，非编码RNA已成为近年来研究的热点，非编码RNA是一类具有调控作用的大部分不编码蛋白质的RNA，经研究非编码RNA在肺癌中亦发挥着重要作用。而长链非编码RNA（lncRNA）是长度大于200nt的非编码RNA，在肺癌中长链非编码RNA已有较多研究报道。长链非编码RNA可作为脚手架分子促使蛋白-蛋白、蛋白-RNA、RNA-DNA相结合调控与肿瘤相关的分子通路或基因表达，从而调控肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡等过程。长链非编码RNA还可作为分子陷阱、分子向导等调控肿瘤发生发展的相关分子机制。已有的研究报道在肺癌中表达异常或发挥重要功能的长链非编

3、码RNA包括HOTAIR、MALAT1、H19、CCAT2等。长链非编码RNACASC2是位于第10号染色体长臂26的长度大约160kb的首次在子宫内膜癌中被发现的lncRNA。目前研究发现CASC2在肿瘤中主要发挥负性调控作用。在结直肠癌、胃癌、肾细胞癌及神经胶质瘤中均有lncRNACASC2的相关报道。在非小细胞肺癌中lncRNACASC2的表达下调与患者的临床分期及肿瘤大小具有相关性，且lncRNACASC2能够抑制肺癌细胞系的增殖及动物体内肺癌移植物的肿瘤生长。然而关于lncRNACASC2在非小细胞肺癌中的作用机制研究报道较少，且在lncRNACASC2对肺癌细胞功能中的探索仅

4、局限在对细胞增殖及肿瘤生长的影响。探索研究lncRNACASC2对肺癌细胞迁移侵袭等与肿瘤转移相关的生物学过程对于非小细胞肺癌的治疗及改善预后具有重要意义。目的：本研究我们首次探索了lncRNACASC2在肺腺癌及癌旁组织中的表达改变及其对于肺癌细胞增殖、迁移、转移等过程的影响，并重点研究探索了lncRNACASC2对肺癌细胞上皮-间质转化（EMT）的影响及其作用机制。明确lncRNACASC2在肺腺癌组织及癌旁组织和肺癌细胞株中的表达改变情况，并将其表达改变与肺腺癌患者淋巴结转移、肿瘤大小、TNM分期、Ki-67表达等临床特征进行统计学分析研究其相关性，进一步探索lncRNACASC2

5、表达情况与患者的生存时间之间的关系。明确lncRNACASC2在肺癌细胞中的表达情况及对肺癌细胞的增殖、迁移、侵袭等的影响，探索lncRNACASC2对肺癌细胞系上皮-间质转化（EMT）过程的影响。观察在肺腺癌细胞中的lncRNACASC2对上皮-间质转化（EMT）过程重要调控相关分子SOX4表达的影I响，阐明肺腺癌组织中lncRNACASC2与SOX4的关系。方法：本研究分三个部分，肺腺癌临床样本及患者信息均收集自2010年3月至2017年3月共收集到63对肺腺癌组织及距离肺癌组织15cm以上的癌旁组织，均为青岛大学附属医院胸外科手术所得。63位患者术前均未进行放化疗等治疗性干预手段。

6、术中取得的成对组织均置于冻存管内保存于-80℃冰箱。肺癌细胞系A549、SPCA1、H1975、PC-9及支气管上皮细胞系16HBE均购自上海中科院细胞库。使用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基、37°C、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中进行培养。细胞生长达到80-90%融合时，按照1:3-1:4传代。第一部分提取RNA及荧光实时定量PCR，使用Trizol法提取组织及细胞内总RNA后使用ReverseTraAceqPCRRTKit反转录试剂盒按照说明书方法采用随机引物进行反转录，反转录后使用SYBgreen法进行荧光实时定量PCR。主要观察实时定量PCR的熔解曲线是否为特异性单峰，扩

7、增效率是否一致，Ct值是否在15-30范围内等。最终通过观察肺腺癌组织与癌旁组织中目的基因与GAPDHCt值的差值（即2^-ΔΔCt法）来计算lncRNACASC2在肺腺癌组织中的相对差异。同时进行免疫组化将存放于-80℃肺腺癌组织及癌旁组织解冻后，经过甲醛固定、脱水、包埋、切片等流程后，使用枸橼酸钾溶液加热抗原修复及3%过氧化氢去除内源性过氧化氢酶及使用山羊血清封闭后，用抗Ki-67抗体一抗4℃过夜孵育。第二天使用鼠兔通用型免疫组