小干扰rna 对高糖诱导大鼠肾小管上皮细胞snail 1表达的抑制作用

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1、小干扰RNA对高糖诱导大鼠肾小管上皮细胞Snail1表达的抑制作用作者：方开云石明隽肖瑛桂华珍郭兵张国忠【摘要】目的：观察小干扰RNA对高糖诱导大鼠肾小管上皮细胞Snail1表达的抑制作用及意义。方法：将原代培养肾小管上皮细胞分为5组，（1）对照组（含糖5.5mmol/L）；（2）高糖组（含糖25mmol/L）；（3）Snail1siRNA处理组，转染Snail1siRNA，6h后更换为高糖（含糖25mmol/L）培养；（4）ControlsiRNA处理组，转染ControlsiRNA作为阴性对照，6h后换为高糖（含糖25mmol/L）培养；（5）高渗组(含甘露醇19.5mmol/

2、L)。72h后收集细胞，用Westernblot检测Snail1、Vimentin蛋白表达，用半定量RTPCR检测Snail1、Vimentin、成纤维细胞特异性蛋白-1（FSP1）和纤维连接蛋白（FN）的mRNA表达。结果：肾小管上皮细胞转染Snail1siRNA后，与高糖组比较Snail1mRNA和蛋白表达分别下降62%和68%（P<0.01）；与高糖组比较，Snail1siRNA处理组Vimentin、FSP1、FN蛋白和（或）mRNA表达显著下调（P<0.01）。结论：(1)小干扰RNA能显著抑制高糖诱导大鼠肾小管上皮细胞Snail1表达；(2)Snail

3、1参与了高糖作用下肾小管上皮细胞病理改变，并在细胞外基质的沉积中起重要作用。【关键词】RNA小干扰上皮细胞肾小管snail1波形蛋白11蛋白质类大鼠SpragueDawleySnail1属于锌指转录因子Snail超家族成员，研究显示该基因在正常胚胎发育和肿瘤的浸润、转移机制中有重要作用[1，2]。报道认为Snail1参与腹膜纤维化[3]和单侧输尿管梗阻肾脏纤维化[4]的发生。本实验前期研究发现，Snail1蛋白在糖尿病大鼠肾小管高表达，用胰岛素将糖尿病大鼠血糖控制到正常水平后，Snail1蛋白的表达明显减少，表明糖尿病状态促进了肾脏Snail1的表达；并且胰岛素治疗组大鼠在肾脏S

4、nail1表达回降的同时，肾功能及肾脏病理改变逐渐改善，提示Snail1与糖尿病肾病（diabeticnephnopathy,DN）的发生、发展有关[5～6]。为进一步证实这一推测，2007年7月应用小RNA干扰技术，通过特异性的Snail1siRNA转染原代培养肾小管上皮细胞，观察高糖刺激下Snail1表达的变化及意义。1材料和方法1.1材料1.1.1动物雄性SD鼠，体重（100～120）g，由贵阳医学院实验动物中心提供。1.1.2主要试剂11DMEM（含糖5.5mol/L）、胎牛血清（HyClone），胰蛋白酶、EDTA（Sigma）；羊抗大鼠Snail1多克隆抗体（SC10

5、432）、驴抗羊lgGHRP、TBSBlottoABlockingReagent、Snail1siRNA（SC38399）、siRNATransfectionReagent（sc29528）、siRNATransfectionMedium（sc36868）、siRNADilutionBuffer（sc29527）、FluoresceinConjugatedControlsiRNA（sc36869）（SantaCruz）；抗波形蛋白（vimentin）抗体，抗βactin抗体、SABC，DAB试剂盒(武汉博士德)。EZSpinColumnRNAPurificationK

6、it（BBI）、RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit（Fermentas）、Snail1、Vimentin、成纤维细胞特异性蛋白1（fibroblastspecificprotein1,FSP1）、FN和βactinPCR引物为上海生物工程有限公司提供。1.2方法1.2.1肾小管上皮细胞的原代培养采用大鼠原代肾小管上皮细胞培养方法[7]，取初代细胞为实验所用。1.2.2细胞分组、转染初代细胞按2×105/孔接种于6孔板中，用不含抗生素的培养基（DMEM+20%FCS）培养24h后，分为：（1）对照组，用DMEM（含糖5.5mmol/L

7、）+2%FCS培养；（2）高糖组，用19.5mmol/LDglucose+DMEM（含糖5.5mmol/L）+2%FCS培养；（3）Snail1siRNA处理组，按操作说明转染Snail1siRNA，611h后换为19.5mmol/LDglucose+DMEM（含糖5.5mmol/L）+2%FCS培养；（4）ControlsiRNA处理组，转染ControlsiRNA作为siRNA阴性对照，6h后换为19.5mmol/LDglucose+DMEM（含糖5.5mm