小干扰rna 对高糖诱导大鼠肾小管上皮细胞snail 1表达的抑制作用

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1、小干扰RNA对高糖诱导大鼠肾小管上皮细胞Snail1表达的抑制作用：方开云石明隽肖瑛桂华珍郭兵张国忠【摘要】目的：观察小干扰RNA对高糖诱导大鼠肾小管上皮细胞Snail1表达的抑制作用及意义。方法：将原代培养肾小管上皮细胞分为5组，（1）对照组（含糖5.5mmol/L）；（2）高糖组（含糖25mmol/L）；（3）Snail1siRNA处理组，转染Snail1siRNA，6h后更换为高糖（含糖25mmol/L）培养；（4）ControlsiRNA处理组，转染ControlsiRNA作为阴性对照，6h后换为高糖（含糖25mmol/L）培养；（5）高渗组(含甘露醇19.5mmol/L)。72h

2、后收集细胞，用edium（sc36868）、siRNADilutionBuffer（sc29527）、FluoresceinConjugatedControlsiRNA（sc36869）（SantaCruz）；抗波形蛋白（vimentin）抗体，抗βactin抗体、SABC，DAB试剂盒(武汉博士德)。EZSpinColumnRNAPurificationKit（BBI）、RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit（Fermentas）、Snail1、Vimentin、成纤维细胞特异性蛋白1（fibroblastspecificprotein

3、1,FSP1）、FN和βactinPCR引物为上海生物工程有限公司提供。1.2方法1.2.1肾小管上皮细胞的原代培养采用大鼠原代肾小管上皮细胞培养方法[7]，取初代细胞为实验所用。1.2.2细胞分组、转染初代细胞按2×105/孔接种于6孔板中，用不含抗生素的培养基（DMEM+20%FCS）培养24h后，分为：（1）对照组，用DMEM（含糖5.5mmol/L）+2%FCS培养；（2）高糖组，用19.5mmol/LDglucose+DMEM（含糖5.5mmol/L）+2%FCS培养；（3）Snail1siRNA处理组，按操作说明转染Snail1siRNA，6h后换为19.5mmol/LD

4、glucose+DMEM（含糖5.5mmol/L）+2%FCS培养；（4）ControlsiRNA处理组，转染ControlsiRNA作为siRNA阴性对照，6h后换为19.5mmol/LDglucose+DMEM（含糖5.5mmol/L）+2%FCS培养；（5）高渗组，用19.5mmol/LDMannitol+DMEM（含糖5.5mmol/L）+2%FCS培养，72h后收集细胞。每个实验组设3个复孔，重复3次实验。贵阳医学院学报34卷2期方开云等小干扰RNA对高糖诱导大鼠肾小管上皮细胞Snail1表达的抑制作用1.2.3in，离心取上清液测定蛋白含量，经SDSPAGE垂直凝胶电泳后

5、，电转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉室温封闭2h，TBST洗膜后分别加抗Snail1（1∶200）和Vimentin(1∶300)抗体，4℃孵育过夜；加相应二抗室温孵育2h，ECL试剂曝光显影。用抗体剥脱液剥脱抗体后，按同样的方法与βactin抗体（1∶500）孵育。凝胶成像系统进行图像分析，以βactin蛋白条带作内参照，结果用靶蛋白/βactin比值表示。1.2.4半定量RTPCR按照试剂盒说明提取细胞总RNA,并逆转录成cDNA，PCR引物序列见表1。PCR反应条件:94℃预变性5min,94℃变性45s,退火30s,72℃延伸45s,40个循环后充分延伸10min。PCR产物

6、经1.5%琼脂糖凝胶电泳和凝胶成像系统分析，计算待测指标与内参βactin灰度比值。1.3统计学分析实验结果以x±s表示，用SPSS11.5统计软件处理。组间比较采用方差齐性检验，单因素方差分析，P<0.05认为差异有显著性。2结果2.1荧光显微镜下观察表1PCR引物序列及扩增条件对照组未检测到Snail1蛋白表达，Snail1mRNA有微量表达，高糖组两者表达均较对照组显著增高（P<0.01）。肾小管上皮细胞转染Snail1siRNA后，与未转染高糖组比较，其Snail1mRNA（图2A）和蛋白（图2B）表达水平分别下降62%和68%（P<0.01）。Controls

7、iRNA不影响Snail1表达水平。2.3VimentinmRNA和蛋白表达结果表明，高糖显著上调VimentinmRNA和蛋白的表达，高渗组与对照组相比，差异无显著性，说明高糖上调肾小管上皮细胞vimentinmRNA和蛋白的表达并不依赖于细胞所处的注：1.对照组，2.高糖组，3.Snail1siRNA处理组，4.ControlsiRNA处理组，5.高渗组；（1）与对照组比较，P＜0.01;(2)与高糖组比较，P＜0.