大黄素对il-1β诱导大鼠肾小管上皮细胞转分化的影响

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1、材料与方法1实验对象实验用正常大鼠肾小管上皮细胞株(NRK52E)源于AmericanTypeCultureCollection(ATCC)，由四川大学华西医院肾内科惠赠。2主要实验药品、试剂及试剂配制2．1药品与试剂大黄素(EMD)南京青泽医药有限公司高糖DMEM培养基美国Sigma公司小牛血清(cs)民海生物胰酶Gibco公司IL一1B美国Cytolab生物公司多聚赖氨酸Boster生物公司4％多聚甲醛Boster生物公司抗大鼠Q—SMA单抗Boster生物公司抗大鼠CK单抗Boster生物公司TritonX．100

2、Costar公司Power-Vision6001二步法试剂盒北京中山生物技术有限公司DAB显色试剂盒北京中山生物技术有限公司2．2试剂配制2．2。1高糖DMEM培养基的配制干粉DMEM培养基1瓶(139)碳酸氢钠3．79三蒸水1000ml充分搅拌至完全溶解，用0．1MNaOH及0．1MHCI调PH值至7．4，经0．22pm微孔滤膜过滤除菌，分装为90mY瓶、95mY瓶，40C保存。临用时取出，90mY瓶的分别加入CSl0ml、青霉素10000IU、链霉素10000“g，则配制成含青霉素100IU／ml、链霉素100I_t

3、g／ml及10％CS的高糖DMEM培养基。95ml／瓶的则分别加入CS5ml、青霉素10000IU、链霉素10000pg，则配制成含青霉素100IU／ml、链霉索100pg／ml及5％CS高糖DMEM培养基。72．2．2D-HanK’S液的配制NaClKClNa2HP04．12H20KI-12P04NaHC03三蒸水溶解后高温高压灭菌，4℃保存。2．2．30．25％胰酶的配制8．090．490．1290．0690．3591000ml胰酶0．259D．HanK’S液100．0ml376C恒温箱静置1小时后用0．229m微孔

4、滤膜过滤除菌，4"C保存。2．2．4IL．1p(20鹇／L)培养液的配制IL-1p10．0995％DMEM培养基500ml溶解后用0．22ttm微孔滤膜过滤除菌，分装、-20X2保存。2．2．5含不同浓度大黄素的培养液配制称取20mg大黄素干粉，溶于Iml二甲桠枫中，再用含5％CS的DMEM培养基100m]稀释，即得含200mg／L大黄素的培养液100ml。临用前取上述大黄素液用含5％CS的DMEM培养基作倍比稀释至所需浓度。2．2．6PBS液(O．01M、PH7．4)的配制NaCl8．09KCl0．29Na2HP04．

5、H201．569KH2P040．29三蒸水1000ml溶解后用0．1MNaOH及0．1MHCI调PH值至7．4，高温高压灭菌，4℃保存。2．2．74％多聚甲醛的配制多聚甲醛4．09PBS液(O．IM)100ml加热至60。C并加数滴0．1MNaOH助溶，常温保存。3主要实验仪器超净工作台YJ-1450国产5％C02孵箱1815TC美国倒置相差镜Oymlpus日本低温冰箱岛津日本电子天平上海天平仪器厂细胞培养板、培养瓶广州仪涛科学仪器厂PH计北京塞多利司有限责任公司Image-Proplus5．01．11分析系统Media

6、Cybernetics．Inc．4实验方法4。1NRK52E细胞的复苏及传代(1)自液氮灌中取出NRK52E细胞冻存管放入38。C温水中，轻摇使其在1分钟内完全融化，酒精擦拭后移入超净台。(2)取冻存管中细胞悬液至离心管，800r／min离心5分钟，弃上清；D．HanK’S液重悬，再800r／min离心5分钟，弃上清。(3)加含10％CS的高糖DMEM培养基，置37。C、5％C0。孵箱培养。(4)次日更换培养基。(5)当细胞贴壁长至80％满时，用D-HanK‘S液淌洗一遍，取0．25％胰酶2ml消化细胞，2～3分钟后用含

7、10％CS的DMEM培养基终止消化并吹打数十次，按1：3比例传代培养。取第3～7代细胞进行实验。4．2实验分组实验用NRK52E细胞按不同处理因素分组，每组设4复孔：(1)对照组：仅加入5％CS的高糖DMEM培养基；(2)EMD。。组：加含大黄素的5％CS高糖DIVlEM培养基，大黄素终浓度为12．5mg／L：(3)EMD2。组：加含大黄素的5％CS高糖DMEM培养基，大黄素终浓度为25mg／L,(4)EIVID5。组：加含大黄素的5％CS高糖DMEM培养基，大黄素终浓度为50mg]L；(5)EMD。。。组：加含大黄素的

8、5％cs高糖DMEM培养基，大黄素终浓度为100mg／L。(6)几一1p诱导组：加含IL一1p的5％CS高糖DMEM培养基，IL．1B终浓度为10pg几；(7)IL—Ip+EMDl2．5组：同时加含IL．1p及大黄素的5％CS高糖DMEM培养基，IL-Ip终浓度为10pg／L，大黄素终浓度为12．5mg／L(8)IL