活化的巨噬细胞诱导肾小管上皮细胞转分化

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1、活化的巨噬细胞诱导肾小管上皮细胞转分化ActivatedmacrophageinducesEpithelial-MesenchymalTransitionofrenaltubularepithelialcell作者姓名：杜伟专业名称：病理学与病理生理学指导教师：吴珊教授学位类别：医学硕士答辩日期：2015年5月21日中文摘要活化的巨噬细胞诱导肾小管上皮细胞转分化终末期肾脏疾病最为理想及有效的治疗方法是肾移植。近年来，肾移植短期存活率有了明显提高，而肾移植远期存活率仍然不容乐观，移植肾慢性肾功能的丧失最终表现为肾纤维化。肾纤维化

2、的主要病理学特征是肾小管萎缩同时伴有间质纤维组织增生。间质纤维组织大量累积是由肌成纤维细胞活化增生引起的，肌成纤维细胞的来源有多个学说，目前研究认为肌成纤维细胞的一个重要来源是肾小管上皮细胞向间充质细胞转分化，即Epithelial-MesenchymalTransition（EMT）。有实验表明，T淋巴细胞可以直接破坏肾小管基膜，表现为“小管炎”，并且肾移植排斥时有大量淋巴细胞浸润，因此以前人们都认为主要是T淋巴细胞介导肾移植排斥反应的发生。然而，有研究表明，肾移植排异中，间质也有巨噬细胞浸润，尤其是BanffⅠb及以上级别

3、的排异中间质巨噬细胞浸润更多。基于以上研究，我们把目光集中在巨噬细胞上，研究巨噬细胞是否在肾小管上皮细胞的EMT过程中发挥重要作用。目的：本实验采用脂多糖（LPS）体外激活鼠巨噬细胞株J774，然后用其培养上清诱导大鼠肾小管上皮细胞株NRK52E，观察其能否促使NRK52E细胞发生EMT，并通过分析活化巨噬细胞培养基中的细胞因子成分，进一步探讨巨噬细胞在促进EMT发生过程中的相关作用机制。方法：鼠巨噬细胞(J774)分别在含1µg/ml，1.5µg/ml，2.5µg/ml和5µg/ml脂多糖（LPS）的DMEM培养基中体外刺激

4、24小时和48小时，用酶联免疫吸附法（ELISA）检测巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）的情况，并观察用含2.5µg/mlLPS的DMEM培养基刺激24小时后J774的形态改变。将2.5µg/ml的LPS刺激24小时后的巨噬细胞消化离心，并用无血清DMEM培养基洗涤细胞沉淀三次，收集第三次洗涤培养基做对照培养基。然后用无血清DMEM培养基重悬巨噬细胞，继续培养48小时，离心取上清做诱导培养基。将NRK52E分为对照组和诱导组，对照组NRK52E的培养条件为对照培养基和DMEM按2:1混合后加

5、FBS使其最终浓度是5%，诱导组的培养条件I为诱导培养基和DMEM按2:1混合后加FBS使其最终浓度是5%。在倒置显微镜下观察培养48小时的对照组和诱导组NRK52E细胞，用Real-TimePCR、WesternBlot和免疫细胞化学染色方法检测NRK52E细胞的上皮标记物，如E-钙粘蛋白（E-Ca），细胞角蛋白-19（CK19）和间充质标记物，如α-平滑肌动蛋白（α-SMA），Vimentin。并采用ESI质谱实验检测经LPS（2.5µg/ml）激活24小时的巨噬细胞J774上清中分泌的细胞因子。结果：ELISA检测结果表

6、明，未刺激组巨噬细胞J774用含LPS浓度为0的DMEM培养24小时或48小时后，J774培养上清中均未检测到TNF-α和IL-6的存在。刺激组巨噬细胞J774用含1µg/ml，1.5µg/ml，2.5µg/ml和5µg/mlLPS的DMEM培养基培养24小时或48小时后，J774培养上清中都检测到有明确的TNF-α和IL-6分泌，表明不同浓度的LPS刺激J774作用24小时或48小时，都激活了J774巨噬细胞。但是用低浓度（1µg/ml）LPS刺激48小时与刺激24小时相比，J774上清中TNF-α和IL-6的含量都有下降，

7、因此我们在后续激活巨噬细胞的实验中，选择LPS的刺激时间是24小时。当LPS浓度为2.5µg/ml，刺激巨噬细胞J774作用24小时后，J774培养上清中含有较高浓度的TNF-α和IL-6，因此综合考虑，我们选择LPS激活巨噬细胞的浓度为2.5µg/ml，刺激时间为24小时。后续实验中，用LPS（2.5µg/ml）刺激J774作用24小时，倒置显微镜下发现J774由圆形伸出伪足，煎蛋样贴壁生长。以上结果表明，LPS在体外激活了J774细胞。分别在对照培养条件下和诱导培养条件下培养NRK52E48小时后，与对照组相比，诱导组NR

8、K52E形态发生变化，由连接紧密的铺路石样上皮细胞转化为细胞间隙增大的长梭形间质样细胞。Real-TimePCR结果表明，与对照组细胞相比，诱导组NRK52E的上皮细胞标记物CK19的mRNA表达量降低，是对照组NRK52E的29%，而间充质标记物α-SMA的mRNA表达量上