安肾胶囊对膜性肾病大鼠治疗作用的实验研究

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安肾胶囊对膜性肾病大鼠治疗作用的实验研究【摘要】目的：研究安肾胶囊对膜性肾病大鼠的治疗作用及机理。方法：将50只SD雄性大鼠制成膜性肾病大鼠模型，然后按24h尿蛋白定量结果随机分为模型组、雷公藤多苷组、安肾胶囊高、中、低剂量组（n＝10），另外将10只未造模大鼠作为正常组。将各组大鼠分别灌胃4w后，观察各组大鼠尿蛋白定量、血尿程度及肾脏组织病理学改变。结果：与模型组比较，安肾胶囊高、中、低剂量组和雷公藤多苷组大鼠的24h尿蛋白定量降低、血尿减轻、肾脏组织病变减轻。结论：安肾胶囊对膜性肾病大鼠具有降低蛋白尿、控制血尿、修复肾小球病理损伤的作用，这可能是其治疗膜性肾病大鼠的作用机制。【关键词】安肾胶囊膜性肾病难治性肾病综合征实验研究安肾胶囊根据难治性肾病反复发作、病程长久、对激素依赖或使用激素治疗无效的特点创立，主要用于难治性肾病痰瘀互结证。本实验采用膜性肾病大鼠模型，运用安肾胶囊治疗，通过观察各指标的改变，研究本方药对肾病大鼠的治疗作用和机理。1材料与方法1.1实验材料8 1.1.1实验动物SD雄性大鼠，体重（150±30）g，由国家药品监督管理局四川抗菌素工业研究所实验动物中心提供。实验期间饲养于室温（20±3）℃环境，相对湿度：70％，12h光、12h暗的条件下，自由摄食全价大颗粒，饮水，驯养1w后使用。1.1.2药品及试剂安肾胶囊浸膏：由成都中医药大学附属医院药厂提供，棕褐色浸膏，每毫升含生药3g。雷公藤多苷片：湖南省株洲市制药三厂生产，批号：066002，10mg/片。阳离子化牛血清白蛋白（C-BSA）、弗氏不完全佐剂：由四川大学华西医学中心提供。磺柳酸法试剂：成都中医药大学附属医院检验科自配。Buin＇s固定液、磷酸缓冲液（PBS）和2.5%戊二醛固定液：成都中医药大学附属医院药理研究室提供。1.2实验方法1.2.1造模参照黄小平等［1］报告的大鼠原位性肾小球肾炎模型制作方法：取雄性SD大鼠70只，放入大鼠代谢笼中（每笼1只），收取大鼠24h尿液，作常规测定。选取小便正常大鼠作为受试动物，除随机抽取10只作正常组外，其余50只大鼠均制成膜性肾病模型：（1）预免疫：取1mL浓度为28 mg/mL的C-BSA溶液与弗氏不完全佐剂混匀的乳白色悬液，分别一次性于每只大鼠的双侧腋下、腹股沟处作多点皮下注射,观察1w。（2）免疫：预免疫结束1w后，每只大鼠尾静脉注射1mL浓度为2.5mg/mLC-BSA，每周3次，共3w。整个造模时间共4w，造模完成后取所有实验动物24h尿液作24h尿蛋白定量测定，根据检测结果进行分组。1.2.2分组将造模后的50只大鼠，按24h尿蛋白定量结果随机分5组，分别为模型组、安肾胶囊高剂量组（高剂量组）、安肾胶囊中剂量组（中剂量组）、安肾胶囊低剂量组（低剂量组)、阳性药物对照组即雷公藤多苷组。另外将10只同批大鼠作为正常组。1.2.3给药造模4w分组后灌胃，具体如下：正常组、模型组：每天灌服等容量（1mL/100g）的蒸馏水。安肾胶囊高、中、低剂量组：每天灌服剂量分别为5g/kg、2.5g/kg、1.25g/kg的安肾胶囊混悬液。雷公藤多苷组：每天灌服剂量为0.03g/kg的雷公藤多苷片混悬液。每天灌胃1次，连续4w，大鼠每周称重1次，根据体重调整给药剂量。1.2.4指标观察及检测方法1.2.4.124h尿蛋白定量观察：收集大鼠24h尿液，用磺柳酸法测定尿蛋白含量，24h尿蛋白定量＝尿蛋白含量/L×24h尿量。1.2.4.2血尿检测：收集每只大鼠248 h尿液，离心取上清液，采用H－100全自动尿液分析仪检测。1.2.4.3肾脏组织形态学变化：灌胃4w后，将大鼠断头处死，立即分离肾脏，观察肾脏外观形态。随机间隔取材，取1个肾脏经肾门均匀纵切,随机间隔取样2块置于Bouins液中固定，逐级乙醇脱水，浸蜡，石蜡包埋，常规切片5μm2张，经“PAS＋苏木精”染色，常规光镜观察，另1个肾脏经肾门最大面均匀切取1/6，置于2.5％戊二醛中固定，送检经透射电镜观察、照相。1.3统计学方法采用SPSS11.0统计软件处理，计量资料数据以平均值加减标准差（■±s）表示，采用单因素方差分析，组间比较采用q检验；等级资料采用Ridit分析。2结果2.1各组大鼠的一般情况变化正常组：大鼠饮食如常，反应灵敏，活动正常，体毛顺滑有光泽，二便正常。其余各组在受试期间见：致病免疫28 w后，动物大多表现为蜷缩少动，精神萎靡，体毛蓬松少光泽，饮食量少，部分大鼠尿液呈茶红色，有明显腹水及呼吸道感染，大便干、少；经给药治疗后，大鼠精神好转，进食稍有增加，反应灵活，小便转清，无明显肉眼酱红色尿，大便质软，量多。2.2治疗前后各组大鼠24h尿蛋白定量变化情况结果见表1。从表1可以看出，除正常组大鼠外，其余各组大鼠经注射C-BSA4w造模后，24h尿蛋白含量明显升高，与正常组比较均有显著性差异。经给药治疗4w后，各药物治疗组24h尿蛋白均显著降低，尤以安肾胶囊中量剂组和雷公藤多苷组降低明显，与模型组比较有非常显著性差异（P<0.01），安肾高剂量组和低剂量组次之；而安肾胶囊高剂量组与模型组比较，有显著性差异（P<0.05）。2.3治疗后各组大鼠血尿情况结果见表2。由表2可看出，治疗4w后用药各组血尿程度均有所减轻，与模型组比较有显著性差异（P＜0.05），而组间比较无明显差异。2.4肾脏组织形态学检查结果8 2.4.1肾小球病理形态光镜检查结果正常组：肾小球呈圆形或卵圆形，可见肾小球毛细血管壁内皮细胞、上皮细胞、系膜细胞形态正常，基底膜完整、规则、均匀一致；肾小球囊腔清晰，未见异常。模型组：肾小球体积增大，囊腔变窄；毛细血管腔狭窄，毛细血管基底膜弥漫性增厚，可见毛细血管小叶边缘呈结节状（毛细血管丛分叶明显）；细胞数增加，系膜基质增多；近曲小管水肿。高、中、低剂量组及雷公藤多苷组：肾小球体积略增大，但较模型组有所减轻，肾小球毛细血管基底膜增厚及变形有改善，肾小球囊腔大小接近正常，细胞数稍增加，基质略增多，毛细血管丛分叶现象轻微。结果见图1。2.4.2超微结构检测结果正常组：肾小球滤过屏障三层结构完整、规则，肾小球毛细血管内皮细胞形态正常，分布均匀，上皮细胞足突排列整齐，无融合；基底膜规则，均匀一致，无增厚。模型组：肾小球毛细血管基底膜弥漫性增厚，内皮细胞增生，上皮细胞肿胀，足突广泛融合，系膜基质增生。部分肾小球滤过屏障三层结构紊乱。高剂量组：肾小球滤过屏障结构仍不规则，基底膜厚薄不均，上皮细胞肿胀,足突大量融合，较模型组病变改变不明显。中、低剂量组：肾小球轻微肿胀，基底膜增厚不明显，上皮细胞足突部分融合，与模型组比较病变有所减轻。雷公藤多苷组：肾小球上皮细胞足突不清晰，有部分融合，基底膜增厚。结果见图2。3讨论8 难治性肾病综合征之难治，一方面是由于脾肾亏损，而更主要的是由于湿、痰、瘀在整个疾病过程中互为因果，影响疾病发生发展致肺脾肾更加受病，水饮积聚，停滞成痰，凝痰聚瘀；凝血不散，水津混渗，血瘀痰滞，致痰瘀相互交结难解，故痰浊、瘀血互为因果，闭阻肾络是该病病机的特点。难治性肾病综合征在疾病过程中的一些宏观和微观表现（肾小球致基底膜增生、增厚、系膜细胞增生，足突融合，环丛节段硬变，管腔闭塞等一系列改变），均与中医痰瘀互结病理相似；现代中医工作者引进现代医学“病”的概念，重视肾病辨证规范化和客观化的研究，将辨病与辨证相结合，使证候辨析渐趋统一。有报道也肯定了这种微观的肾脏形态学改变可称为“肾内微型癥积”，其病理基础即为痰瘀互结［2］。据此拟定安肾胶囊，治疗难治性肾病综合征，临床获相当疗效，本方由三棱、白芥子、莪术、瓦楞子等组成，诸药合用共奏消痰软坚散结之功，化痰祛瘀，双管齐下，使痰瘀分解；本实验亦证实此方能有效降低膜性肾病大鼠蛋白尿、减轻血尿、改善基底膜损伤程度，这正是其治疗难治性肾病的作用机理。可见，安肾胶囊组方不仅有中医理论指导，而且有现代医学研究佐证，有较强的科学性。【参考文献】［1］黄小平，李成进，李士梅.大鼠原位性肾小球肾炎模型的建立［J］.中山医科大学学报，1991，12（2）:86-88.8 ［2］王永钧，张敏鸥.痰瘀互结与肾内微型癥积［J］.中国中西医结合肾病杂志，2003，4（1）：1-3.8