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密级：学号：201302032016届硕士研究生学位论文基于Wilson病肝纤维化临床证候特征的肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化免疫组化研究IMMUNOHISTOCHEMICALSTUDIESOFGANDOUFUMUTANGTOWARDSHEPATICFIBROSISINTXMICE,WHICHBASEDONCLINICALSYNDROMEFEATURESOFHEPATICFIBROSISOFWILSONDISEASE作者姓名谢文婷申请学位级别硕士研究生指导教师姓名杨文明职称教授、主任医师学科专业中西医结合临床(神经病学)研究方向Wilson病基础与临床研究学习时间自2013年9月起至2016年6月止论文提交日期2016年3月18日论文答辩日期2016年5月26日学位授予单位安徽中医药大学学位类型专业学位 学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下立进行研究，独工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中１＾１明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者（需亲笔）签名：护女月么ｋ日学位论文版权使用授权书本人完全了解安徽中医葫大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权安徽中医药大学可Ｗ将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可Ｗ采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密ｔ／。＿＿‘＂＂（请在Ｗ上方框内打Ｖ）学位论文作者（需亲笔）签名：之々心年ｒ月王レ３导师（需亲笔）签名：］ 目录中文摘要……………………………………………………………1英文摘要……………………………………………………………3缩略词表……………………………………………………………6前言……………………………………………………………7第一部分Wilson病肝纤维化临床证候特征研究1临床资料…………………………………………………………92研究方法…………………………………………………………103研究结果…………………………………………………………114讨论………………………………………………………………16第二部分肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化免疫组化研究1实验材料…………………………………………………………222实验方法…………………………………………………………233实验结果…………………………………………………………254讨论………………………………………………………………45结论………………………………………………………………54参考文献……………………………………………………………55综述………………………………………………………………63个人简介……………………………………………………………75致谢………………………………………………………………76 基于Wilson病肝纤维化临床证候特征的肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化免疫组化研究中文摘要目的：（1）以Wilson病（WD）肝纤维化患者作为研究对象，在充分收集临床资料的基础上，运用临床流行病学及数理统计分析方法，开展对WD肝纤维化中医证候学研究，以期揭示WD肝纤维化中医基本证候特征，为深化WD肝纤维化中医治疗提供依据；（2）以WD模型TX小鼠作为研究对象，应用可逆转WD肝纤维化临床关键病机的肝豆扶木汤（GDFMT），在GDFMT的作用、不同浓度及不同时间干预下，采用免疫组化法检测肝组织中TGF-β1、TβRI、TβRII、Smad2、Smad3、Smad4和Smad7蛋白的表达，探讨GDFMT抗WD肝纤维化的作用及其可能的分子机制。方法：临床部分对符合纳入标准的118例WD肝纤维化患者，按照拟定设计的WD肝纤维化中医证候调查表进行常见中医症状、体征及人口学资料调查，运用聚类分析、判别分析等数理统计分析方法，揭示WD肝纤维化临床症状和证候分布规律与特点。实验部分96只雄性TX小鼠随机分为模型组（生理盐水）、青霉胺组（青霉胺）、丹参组（丹参）、GDFMT低剂量组（简称低剂量组）、GDFMT中剂量组（简称中剂量组）、GDFMT高剂量组（简称高剂量组）；另设正常对照组DL小鼠16只，共7组。7组小鼠分别给予相应的药物灌胃处理，每天1次，连续28天，于灌胃后2、4周结束时分批处死动物，每组每次8只。采用免疫组化SP法检测小鼠肝组织TGF-β1、TβRI、TβRII、Smad2、Smad3、Smad4和Smad7蛋白的表达。结果：（1）临床部分：1）WD肝纤维化病位涉及肝、肾、脾、心四脏；其病变脏腑顺位为肝、肾、脾、心，肝脏累及频次最高；2）病变性质为虚实夹杂之证，虚主要1 中文摘要为肝肾亏虚、脾气亏虚，实主要为痰浊内蕴、瘀阻脉络；证候方面以肝肾亏虚、痰瘀互结证多见；3）WD肝纤维化中医证候分布与患者年龄和病程有关，与性别无关。（2）实验部分：1)治疗2周和治疗4周后均可见如下结果。与正常组比较，模型组TGF-β1、TβRI、TβRII、Smad2、Smad3和Smad4蛋白的表达明显升高，Smad7蛋白的表达明显降低(P<0.01)。与模型组比较，各治疗组TGF-β1、TβRI、TβRII、Smad2、Smad3和Smad4蛋白表达均降低，Smad7蛋白表达则升高(P<0.05，P<0.01)。与丹参组、青霉胺组及低、中剂量组比较，高剂量组TGF-β1、TβRI、TβRII、Smad2、Smad3和Smad4蛋白表达明显降低，Smad7蛋白的表达则明显升高(P<0.01)。与青霉胺组及低剂量组比较，丹参组和中剂量组TGF-β1、TβRI、TβRII、Smad2、Smad3和Smad4蛋白表达均明显降低，Smad7蛋白的表达明显升高(P<0.05，P<0.01)；而丹参组与中剂量组的比较差异无统计学意义(P>0.05)。与低剂量组比较，青霉胺组TGF-β1、TβRI、TβRII、Smad2、Smad3和Smad4蛋白的表达降低，Smad7蛋白的表达升高(P<0.05，P<0.01)。2）与治疗2周结果比较，各治疗组在治疗4周结束TGF-β1、TβRI、TβRII、Smad2、Smad3、Smad4蛋白表达均降低，Smad7蛋白表达则升高(P<0.05，P<0.01)。结论：(1)WD肝纤维化以肝肾亏虚、痰瘀互结证为主要特征，病变脏腑顺位为肝、肾、脾、心；中医证候分布与WD肝纤维化患者年龄和病程有关，与性别无关。(2)GDFMT能有效抑制TGF-β1、TβRI、TβRII、Smad2、Smad3、Smad4蛋白的表达，促进Smad7蛋白表达，并呈显著剂量、时间依赖性，从而降低肝星状细胞（Hsc）的活化，减少细胞外基质（ECM）的分泌，发挥抗肝纤维化作用。关键词：Wilson病；肝纤维化；证候特征；肝豆扶木汤；TX小鼠；免疫组化2 基于Wilson病肝纤维化临床证候特征的肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化免疫组化研究AbstractObjectives:(1)AstheresearchobjectwithWDliverfibrosispatients,onthebasisoffullycollectedclinicaldata,usingepidemiologicalandclinicalanalysisofmathematicalstatisticsmethod,carryouttheWDstudyofsyndromesofliverfibrosis,inordertorevealthebasicsyndromecharacteristicsoftraditionalChinesemedicineofWDliverfibrosis,inordertofurtherputforwardquantitativeWDliverfibrosis,whichprovidethebasisfordeepeningtraditionalChinesetreatmentofWDliverfibrosis.(2)ToobservehowGDFMTatdifferentconcentrationsanddifferenttimeinterventioncanshowtheeffectofanti-hepatibrosisbyusingTXmiceastheresearchobject.UsetheimmunohistochemicalmethodtodetecttheTGF-β1,TβRⅠ,TβRⅡ,Smad2,Smad3,Smad4,Smad7proteinexpressionofliver,andrevealingthepossiblemolecularmechanismsofGDFMTtowardstheeffectofanti-hepatibrosis.Methods:(1)Clinicalstudy:Toconformtotheinclusioncriteriaof118casesofpatientswithWDofliverfibrosisaccordingtothedesignofWDliverfibrosis,questionnairesoncommonTCMsymptoms,signsanddemographicinformation,andusingclusteranalysisanddiscriminantanalysisofmathematicalstatisticsanalysismethod,observingclinicalsymptomsandsyndromedistributionregularandcharacteristicsoftheWDliverfibrosis.(2)Laboratoryexperiments:96maleTXmicearerandomlyallocatedtomodelgroup(physiologicalsaline),penicillaminegroup,Danshengranulesgroup,groupoflowdoseGDFMT,groupofmiddledoseGDFMTandgroupofhighdoseGDFMT.Besides,another16DLmiceareusedasnormalcontrolgroup.Totallysevengroupsofmicearegivencorresponding3 英文摘要drugperfusiontreatmentonetimesadayand28daysinarow.Themiceweresacrificedeightofagroupeachtimeattheendof2,4weeksafterdrugperfusiontreatment.UsetheimmunohistochemicalmethodtodetecttheTGF-β1,TβRⅠ,TβRⅡ,Smad2,Smad3,Smad4,Smad7proteinexpressionoflivertissueofmice.Results:(1)Theclinicalpart:TheWDliverfibrosisinvolvesfourvisceral:tliver,kidney,spleen,heart.Thelesionsinthefourvisceralinorderfortheliver,kidney,spleen,heart,amongthemliverinvolvinghighestfrequency.Forthefactorsofthepathologicalchangenatureisdeficiencyandexcess,virtualmainlyforliverandkidneydeficiency,spleendeficiency,firmmainlyforphlegmturbidityimplication,bloodstasisresistance.Whattoseemoreisaspectedinliverandkidneydeficiency,phlegmandbloodstasissyndrome.ThesyndromesdistributionofWDliverfibrosisisassociatedwithpatients’ageandcourseofthedisease,hasnothingtodowithgender.(2)Experimentalsection:1)Both2and4weeksoftreatmentshowthesameresultsasfollows.TheexpressionofTGF-β1,TβRI,TβRII,Smad2,Smad3andSmad4significantlyincreaseinmodelgroupwhiletheSmad7decrease(P<0.01)whencomparedtonormalgroup.Whileincomparisontomodelgroup,TGF-β1,TβRI,TβRII,Smad2,Smad3andSmad4decreaseandtheSmad7increaseineachdoseofGDFMTgroup,Danshengranulesgroupandpenicillaminegroup(P<0.05,P<0.01).ThequantityofTGF-β1,TβRI,TβRII,Smad2,Smad3,Smad4inhighdosegrouparemuchlowerthanDanshengranulesgroup,penicillaminegroup,lowerandmoderatedosegroup,andSmad7ismuchhigher(P<0.01).TheexpressionofTGF-β1,TβRI,TβRII,Smad2,Smad3andSmad4significantlydecreaseinDanshengranulesgroupandmoderatedosegroupwhiletheSmad7increase(P<0.05,P<0.01)whencomparedtopenicillaminegroupandlowerdosegroup.Thereisnosignificantdifferenceoftheseproteinsinmoderatedosegroup4 基于Wilson病肝纤维化临床证候特征的肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化免疫组化研究andDanshengranulesgroup(P>0.05).Whileincomparisontolowdosegroup,TGF-β1,TβRI,TβRII,Smad2,Smad3andSmad4decreaseandtheSmad7increaseinpenicillaminegroup(P<0.05,P<0.01).2)Comparedwiththeresultsoftreatmentfor2weeks,theexpressionofTGF-β1,TβRI,TβRII,Smad2,Smad3andSmad4aredown-regulatedbytheendof4weeks,butSmad7issignificantlyup-regulated(P<0.05,P<0.01).Conclusion：(1)TheWDliverfibrosisischaracterizedbyliverandkidneydeficiency,phlegmandbloodstasis.Thelesionsinthefourvisceralinorderfortheliver,kidney,spleen,heart.ThedistributionofsyndromesassociatedwithWDliverfibrosisinpatientswithageandcourseofthedisease,hasnothingtodowithgender.(2)GDFMTcandecreasetheexpressionofTGF-β1,TβRI,TβRII,Smad2,Smad3,Smad4andincreasetheexpressionofSmad7,significantlydependingondoseandtimeoftreatment.Thereby,itmayreducetheactivationofhepaticstellatecellsandthesecretionofextracellularmatrix,andplaytheroleofantihepaticfibrosis.Keywords:Wilsondisease;hepaticfibrosis;syndromecharacteristics;GDFMT;TXmice;immunocytochemistry5 英文缩略词英文缩略词缩略词英文全称中文名称ALBalbumin白蛋白ALPalkalinephosphatase碱性磷酸酶ALTalanineaminotransferase丙氨酸氨基转移酶ASTaspartateaminotransferase天门冬氨酸氨基转移酶α-SMAα-smoothmuscleactinα-平滑肌肌动蛋白CPceruloplasmin铜蓝蛋白ECMextracellularmatrix细胞外基质GDFMTGandoufumutang肝豆扶木汤HAhyaluronicacid透明质酸HLDhepatolenticulardegeneration肝豆状核变性Hschepaticstellatecells肝星状细胞IV-Cheartfattyacid-bindingprotein心型脂肪酸结合蛋白LNlaminin层粘蛋白MDAmalondialdehyde丙二醛PCIIIprocollagenIIINterminalpeptideIII型前胶原氨基端肽SODsuperoxidedismutase超氧化物歧化酶TGF-β1transforminggrowthfactor-β1转化生长因子-β1TNF-αtumornecrosisfactor-α肿瘤坏死因子-αTPtotalprotein总蛋白WDWilsondisease威尔逊病6 基于Wilson病肝纤维化临床证候特征的肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化免疫组化研究前言Wilson病（Wilsondisease,WD），又名肝豆状核变性（hepatolenticulardegeneration,HLD），英国学者SamuelA.K.Wilson于1912年首先对其描述，是一种遗传性铜代谢障碍所致的肝硬化和以基底核为主的脑部变性疾病[1]。ATP7B基因突变为本病的主要原因[1,2]，临床表现为肝脏损害、锥体外系症状、精神症状、肾功能损害及角膜色素环（Kayser-Fleischerring,K-F环）。本病的患病率各国报道不一，一般在（0.5-3）/10万，欧美国家少见，但在意大利南部和西西里岛、罗马尼亚、日本、东欧及我国的患病率较高[3]。我国人口基数大，患病的绝对数多，故加强WD研究具有重要的理论及现实意义。铜代谢异常使得过量的铜离子在肝、脑、肾、角膜等组织沉积而致病，出现复杂多样的临床症状，但无论是肝型、脑型或其他类型，患者均存在不同程度的肝脏损害[4]。肝纤维化是一种组织病理学概念，主要是指肝组织内细胞外基质（ECM）成分过度增生、异常沉积，致使肝脏结构或功能异常的病理变化。WD患者肝组织内铜离子长期刺激肝脏可使肝窦内肝星状细胞（Hsc）活化，胶原等ECM成分代谢失衡，生成多于降解，从而使肝脏ECM沉积、组织结构重构[5]。目前西医对于WD肝纤维化治疗手段单一，主要采用铜络合剂驱铜治疗，不良反应较为明显，许多病人因严重不良反应和并发症而用药受限。近年来，中医药多途径、多靶点的抗纤维化作用得到广泛关注，临床应用安全、有效，具有十分广阔的应用前景[6]。证候学是中医理论的核心，疾病的诊治是从症状开始入手的。症状是致病因素作用于人体而产生的各个异常表现和感觉，而证候则是对临床四诊所收集的资料进行加工，综合分析，对疾病过程中某一阶段病理性质高度概括，反映了疾病的病因、病位、病性、病势和邪正双方之间的变化情况，因而比症状更为全面、深刻地揭示并反映疾病的本质。因此，开展对WD肝纤维化的证候研究是提高中医药临床疗效最为本质的内容和不可逾越的途径。在WD肝纤维化的证候研究中，既要尊重证候分型的多样性，又要注意其可操作性和规范性，尽量减少经验性和主观性。在充分收集临床资料的基础上，运用7 前言临床流行病学及数理统计分析方法，开展对WD肝纤维化中医证候学研究，寻找客观中医辨证方法，建立公认、量化的中医证候诊断标准是中医药学术研究的必然趋势，也是规范指导中医药治疗的客观依据。基于WD肝纤维化的主要临床表现，结合对大量WD肝纤维化患者长期的临床观察和新安医学医家中关于脑病的理论及丰富的临床经验，杨文明教授创制了中药复方制剂——肝豆扶木汤（GDFMT）。全方由何首乌、枸杞、土茯苓、白芍、三七、郁金及柴胡等中草药组成，具有补益肝肾、豁痰化瘀之效。前期临床研究表明，GDFMT能够明显改善WD肝纤维化患者UWDRS量表肝脏功能积分，降低肝型WD肝纤维化患者中医证候积分，能促进患者尿铜排泄，降低血清TIMP-1、TGF-β1和TNF-α的含量，提高血清MMP2、MMP9、ALT和AST的水平，发挥抗肝纤维化作用[7,8]。前期实验研究表明，GDFMT能降低WD模型铜负荷大鼠肝铜及血清铜含量，具有排铜功效，并能降低大鼠肝组织中MDA含量，提高SOD活性，纠正氧化、抗氧化失衡，以预防治疗脂质过氧化[9]；能降低其血清中ALT、AST活力及AST/ALT比值，提高血清TP、ALB水平，减轻WD模型大鼠肝细胞坏死、纤维增生及脂肪变性的程度，发挥显著的保肝作用[10]；通过HE和Masson染色观察发现，其还能有效地改善肝纤维化TX小鼠的肝组织病理[8]。然而，GDFMT抗WD肝纤维化作用的可能分子机制目前尚不十分明了，有待进一步研究。本课题临床部分以WD肝纤维化患者作为研究对象，在充分收集临床资料的基础上，运用临床流行病学及数理统计分析方法，开展对WD肝纤维化中医证候学研究，以期揭示WD肝纤维化中医基本证候特征，为深化WD肝纤维化中医治疗提供依据。实验部分以WD模型TX小鼠作为研究对象，应用可逆转WD肝纤维化临床关键病机的GDFMT，在GDFMT的作用、不同浓度及不同时间干预下，采用免疫组化法检测肝组织中TGF-β1、TβRI、TβRII、Smad2、Smad3、Smad4和Smad7蛋白的表达，探讨GDFMT抗WD肝纤维化的作用及其可能的分子机制。本课题研究得到国家自然科学基金（项目编号：81373599）的资助。8 基于Wilson病肝纤维化临床证候特征的肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化免疫组化研究第一部分Wilson病肝纤维化临床证候特征研究1临床资料1.1病例来源本研究于2015年1月—2015年12月在安徽中医药大学第一附院（安徽省中医院）脑病中心展开Wilson病肝纤维化中医证候调查研究，共收集118例资料完整病例。1.2诊断、纳入及排除标准1.2.1WD西医诊断标准[1]（1）肝病史、肝病征或者锥体外系表现；（2）血清CP显著降低和（或）肝铜增高；（3）角膜K-F环阳性；（4）具备阳性家族史。符合（1）、（2）、（3）或（1）、（2）、（4）即可确诊。1.2.2肝纤维化诊断标准[5]（1）慢性肝病史。（2）临床表现：无特异性，可无明显临床症状和体征。除原发病的表现之外，还可表现为疲乏倦怠、食欲不振、肝区胀痛不适、大便异常、面色晦暗、舌质暗红或暗淡以及脉弦细等。（3）实验室检查：血清肝纤维化标志物（HA、LN、PCIII、IV-C）及AST/ALT比值、GGT等异常升高。（4）影像学（B超）检查：可见肝包膜粗糙，回声增强、增密、增粗且分布不均匀，血管走向不清，或可见门脉内径增宽、脾脏增厚等。（5）肝组织病理学检查：肝组织苏木精-伊红染色、Masson三色染色及网状纤维染色可见纤维组织不同程度增生（S1～S4）。（6）危险因素：长期大量饮酒，患者病程较长、年龄较大，体重指数（BMI）增加，胰岛素抵抗，肝细胞脂肪变性，人类免疫缺陷病毒感染及使用免疫抑制剂等。1.2.3WD的临床分型[11]9 第一部分Wilson病肝纤维化临床证候特征研究（1）肝型：表现为持续性血清ALT、AST增高，急性或慢性肝炎，肝硬化（代偿或失代偿期），暴发性肝衰竭（伴或不伴溶血性贫血）；（2）脑型：表现为帕金森综合征，运动障碍（包括手足徐动、舞蹈症状、扭转痉挛、步态异常、共济失调等），口-下颌肌张力障碍（包括讲话困难、声音低沉、吞咽障碍、流涎等）及精神症状；（3）其他类型：以肾损害、骨关节肌肉损害、溶血性贫血为主要表现；（4）混合型：为以上各型的组合。1.2.4病例纳入标准（1）符合WD西医诊断标准；（2）符合肝纤维化诊断标准；（3）WD临床分型符合肝型；（4）年龄8-50岁；（5）患者或家属知情同意。1.2.5排除标准（1）不符合WD西医诊断标准；（2）不符合肝纤维化诊断标准；（3）脑型、其他类型及混合型WD患者；（4）年龄小于8岁或大于50岁；（5）出现暴发性肝衰竭、肝肾综合征或合并肺部感染等患者；（6）不能配合完成研究者。1.3一般资料全部收集118例患者，其中男61例，女57例，年龄最小者8岁，最大者50岁，平均12.43±4.64岁，病程最短者3天，最长者30年，平均5.65±1.92年。2研究方法2.1制定中医证候调查表通过文献调研及临床专家咨询，设计出WD肝纤维化中医证候调查表。调查内容包括患者人口学资料、一般情况、现病史和既往史、个人史和家族史，以及常见中医症状、体征。10 基于Wilson病肝纤维化临床证候特征的肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化免疫组化研究2.2调查表数据采集、整理由相应的专科医师负责，完整采集患者调查表相关数据，并将全部资料录入电子计算机。过程中采用以下方法控制可变因素：固定调查人员，并于调研前参加相关知识培训，统一标准；两名调查人员共同填写、核对每份调查表；两人双机独立录入数据，并进行核对、逻辑检查，在确保无误后锁定数据库。2.3统计学方法采用SPSS17.0软件进行数据管理及统计分析。应用四格表资料的Fisher确切概率法卡方检验；对原始变量作0、1变换处理后，进行指标聚类分析，然后再作判别分析法交互验证，判断其正确率。3研究结果3.1WD肝纤维化的病位分布根据脏腑辨证对中医临床表现进行辨证分析。WD肝纤维化病位涉及肝、肾、脾、心四脏；其病变脏腑顺位为肝、肾、脾、心，肝脏累及频次最高。结果见表1。表1118例WD肝纤维化中医脏腑分布Tab1118casesofWDliverfibrosisinvolvingthedistributionofviscera脏腑频次（n）构成比（n/N%）肝118100.00肾8773.73脾7866.10心6151.69合计344291.533.2WD肝纤维化中医症状及体征分布对118例病人调查发现，WD肝纤维化病人主要表现为：口粘不爽，口苦或臭，口淡不渴，口咽干燥，头晕目眩，纳谷不香，泛恶流涎，肌肤甲错，肢体浮肿，精神抑郁，性情异常，腰酸腿软，五心烦热，盗汗，胁下积块，触按疼痛，固定不移，腹大胀满，青筋暴露，腹痛绵绵，喜温喜按，面色㿠白，小便短少，全身乏力，胸脘痞闷，腹部胀痛，身目发黄，急躁易怒，小便黄赤，腹下坚满，恶心呕吐，沉默寡言，大便不调，形体消瘦，表情淡漠，小便频数，皮肤瘀斑，11 第一部分Wilson病肝纤维化临床证候特征研究两目干涩，少气懒言，齿鼻衄血，舌淡胖，舌干红，舌淡红，舌质黯淡或有瘀斑，脉沉迟等。结果见表2。表2WD肝纤维化中医症状及体征分布Tab2DistributionofTCMsymptomsandsignsinWDliverfibrosis编号（number）症状(symptoms)频次(N)出现率（Percent）X1纳谷不香11294.92%X2口咽干燥10992.37%X3胸脘痞闷10790.68%X4全身乏力10488.14%X5形体消瘦10488.14%X6胁下触痛9983.90%X7泛恶流涎9479.66%X8腰酸腿软9378.81%X9五心烦热9277.97%X10小便短少8874.58%X11口粘不爽8572.03%X12两目干涩8067.80%X13少气懒言8067.80%X14肌肤甲错7866.10%X15大便不调7866.10%X16头晕目眩7462.71%X17苔白腻7059.32%X18脉弦滑6756.78%X19腹大胀满6756.78%X20齿鼻衄血6050.85%X21恶心呕吐5647.46%12 基于Wilson病肝纤维化临床证候特征的肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化免疫组化研究X22小便频数5244.07%X23肢体浮肿4638.98%X24脉弦细数4638.98%X25舌质黯淡或有瘀斑4638.98%X26身目发黄3933.05%X27口苦或臭3832.20%X28舌干红3832.20%X29小便黄赤3731.36%X30急躁易怒3428.81%X31腹痛喜按3126.27%X32脉沉迟2823.73%X33盗汗2622.03%X34青筋暴露2319.49%X35沉默寡言2117.80%X36表情淡漠2117.80%X37皮肤瘀斑2016.95%X38舌淡红1714.41%X39面色㿠白1512.71%X40口淡不渴1311.02%X41舌淡胖1210.17%X42性情异常1210.17%3.3聚类分析结果由于WD肝纤维化的中医症状及体征比较分散，本文将出现频率小于10%的离散数据进行整合压缩，保留一些具有重要鉴别意义的症状因子做系统聚类分析，以得到分布的集中趋势。结果显示，症状因子被聚为肝肾亏虚、痰浊内蕴、瘀阻脉络、脾气亏虚及其他证候（症状分布离散，无显著规律）五类；按照中医虚实辨证分型，聚类肝肾亏虚+痰瘀互结、脾气亏虚+痰湿内蕴、肝肾亏虚+瘀血阻络13 第一部分Wilson病肝纤维化临床证候特征研究属于虚实夹杂证范畴；聚类痰湿内蕴+瘀血阻络属于实证范畴；临床以肝肾亏虚、痰瘀互结证多见。结果见图1，表3。图1症状指标系统聚类图Fig.1Theclusterdiagramofsymptomindex表3WD肝纤维化患者中医证候分布Tab3DistributionofTCMsyndromesinWDpatientswithliverfibrosis证候例次（n）构成比（n/N%）肝肾亏虚、痰瘀互结证7361.86痰湿内蕴、瘀血阻络证3227.12脾气亏虚、痰湿内蕴证54.24肝肾亏虚、瘀血阻络证54.24其他证候32.54合计1181003.4判别分析结果对系统聚类分型结果作判别分析验证。运用已建立的判别方程，将原始资料逐一回代重判别，作交互验证，结果全部118例中有112例判别正确,判别正确率为94.92%。14 基于Wilson病肝纤维化临床证候特征的肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化免疫组化研究3.5WD肝纤维化中医证候分布与性别的关系118例患者中，男性有61例、女性有57例，男：女为1.07:1。中医证候分布与WD肝纤维化患者性别无关。结果见表4。表4中医证候与性别的分布比例Tab4DistributionproportionofTCMsyndromesandgender证候例数（n）男（%）女（%）肝肾亏虚、痰瘀互结证7337（60.66%）36（63.16%）痰湿内蕴、瘀血阻络证3218（29.51%）14（24.56%）脾气亏虚、痰湿内蕴证52（3.28%）3（5.26%）肝肾亏虚、瘀血阻络证52（3.28%）3（5.26%）其他证候32（3.28%）1（1.75%）合计11861573.6WD肝纤维化中医证候的年龄段分布118例患者中，年龄最小者8岁，最大者50岁，中医证候分布与WD肝纤维化患者年龄有关。结果见表5。表5WD肝纤维化患者中医证候的年龄段分布Tab5AgedistributionofTCMsyndromesofWDpatientswithliverfibrosis证候例数（n）8-20岁21-30岁31-40岁41-50岁肝肾亏虚、痰瘀互结证73481861痰湿内蕴、瘀血阻络证32181121脾气亏虚、痰湿内蕴证53110肝肾亏虚、瘀血阻络证52210其他证候31110合计11872331123.7WD肝纤维化中医证候与病程的关系根据病程对WD肝纤维化中医证候进行辨证分析。中医证候分布与患者病程有关，其中最早出现的是脾气亏虚、痰湿内蕴证，而痰湿内蕴、瘀血阻络证出现最晚。结果见表6。15 第一部分Wilson病肝纤维化临床证候特征研究表6WD肝纤维化中医证候与病程的关系Tab6RelationshipbetweenTCMsyndromesanddiseasecourseofWDliverfibrosis例数0-3年4-6年7-9年＞10年证候（n）例数（n）例数（n）例数（n）例数（n）肝肾亏虚、痰瘀互结证7311（50.00%）27（79.41%）26（68.42%）9（37.50%）痰湿内蕴、瘀血阻络证324（18.18%）4（11.76%）11（28.95%）13（54.17%）脾气亏虚、痰湿内蕴证54（18.18%）1（2.94%）0（0%）0（0%）肝肾亏虚、瘀血阻络证53（13.64%）2（5.88%）0（0%）0（0%）其他证候30（0%）0（0%）1（2.63%）2（8.33%）合计118223438244.讨论4.1中医对WD肝纤维化病因病机认识中医没有Wilson病之名，亦无肝纤维化的记载，但根据其复杂多样的临床表现及证候特点，可将WD归属于“肝风”、“颤振”、“痉证”、“癫狂”、“鼓胀”、“积聚”、“黄疸”等范畴；WD所致肝纤维化可归于“黄疸”、“胁痛”、“积聚”、“肝积”等范畴。《素问·至真要大论》曰：“诸风掉眩，皆属于肝”。《医学纲目·颤振》曰：“风颤者，以风入于肝脏经络，上气不守正位，故使头招面摇，手足颤掉也”。《临证指南医案·肝风》云：“肝为风木之脏，因有相火内寄，体阴用阳，其性刚，主动主升……倘精液有亏，肝阴不足，血燥生热，热则风阳上升，窍络阻塞，头目不清，眩晕跌仆，甚则瘛疭厥矣”。《灵枢·水胀》篇载：“鼓胀何如？岐伯曰：腹胀，身皆大，大与肤胀等也，色苍黄，腹筋起，此其候也”。《张氏医通·杂门》谓：“有瘀血发黄，大便必黑，腹胁有块或胀，脉沉或弦”。《灵枢·五邪》云：“邪在肝，则两胁中痛……恶血在内”。杨文明认为WD的中医病机完全符合肝风证病机，主张将其归为“肝风”范畴，其在《肝风论》[12]一文中有详细论述。WD的发病机理十分复杂，尚未完全阐明。杨任民[13]认为，WD的主要病机为铜毒内聚、湿热内蕴。汪瀚等[14]认为铜毒内蕴为主要病机，且贯穿于疾病发生、16 基于Wilson病肝纤维化临床证候特征的肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化免疫组化研究发展和变化的整个过程。王殿华等[15]指出，该病为脏腑功能失调、铜浊代谢排出障碍、蓄积于体内所致，其病机特点为肝胆郁结、铜浊蓄积，毒邪滞络。杨文明等[16]提出，该病病因病机为禀赋不足、铜毒内生，铜浊邪毒、酿生湿热，火热燔灼、引动肝风，痰瘀互结、形成癥积。病位起于肾，累及肝；以热、毒、痰、瘀为主要病理因素；虽以虚为主，但往往因虚致实，形成“本虚标实”、“虚实夹杂”的致病特点[17]。肝纤维化作为一切肝病的共同病理学基础，不同的医家对其病机的认识有所不同，目前主要有以下5种论说，即瘀血论、痰浊论、毒邪论、络病论和正虚论[18]。但实际临床工作中，肝纤维化是一个动态变化的复杂过程，其病机往往是复合病机，并非单一的一种。薛博瑜等[19]认为湿热疫毒入侵为肝纤维化的主要病因，并与正气不足有关，其病机关键为热毒瘀结、肝脾损伤。齐洪军等[20]认为，痰瘀互结，阻滞肝络是肝纤维化病机的关键，亦是共同的病理基础。鲁玉辉等[21]提出，湿热为肝纤维化发展的始动因素，久则化瘀入络。周涛等[22]认为铜毒内聚、腑气不通，瘀血阻络为WD肝纤维化的关键病机。中国中西医结合肝脏病学会[5]亦对肝纤维化的病机提出指导意见，认为其基本证候病机为正虚血瘀，在疾病的不同阶段可表现为肝胆湿热、肝郁脾虚、肝肾阴虚等不同的证候类型。各医家虽对肝纤维化的病因病机认识有不同侧重，但湿热毒邪、正虚瘀结的病机是普遍认为存在的。4.2WD肝纤维化临床证候研究证候学是中医理论的核心。疾病的诊治是从症状开始入手的。症状是致病因素作用于人体而产生的各个异常表现和感觉，而证候则是对临床四诊所收集的资料进行加工，综合分析，对疾病过程中某一阶段病理性质高度概括，反映了疾病的病因、病位、病性、病势和邪正双方之间的变化情况，因而比症状更为全面、深刻地揭示并反映疾病的本质。因此，开展对疾病的证候研究是提高中医临床疗效最为本质的内容和不可逾越的途径。近50年来，证候一直是研究的热点，但始终是有进步而无突破，究其原因，除研究思路有待调整外，原始积累性工作薄弱、缺乏科学的证候诊断和评价标准是重要的制约因素[23]。此外，中医证候是具有非线性特征的复杂系统，确定性中包含有内在随机性，因而，证候类型是复杂多样的，这也决定了证候分型的相对17 第一部分Wilson病肝纤维化临床证候特征研究性，是把复杂问题简单化的结果。所以，在证候研究中，既要尊重证候分型的多样性，又要注意其可操作性和规范性，尽量减少经验性和主观性。以具体的疾病作为突破口，寻找客观中医辨证方法，揭示疾病的中医证候特征，深化疾病的中医药治疗是中医药学术研究的必然趋势。本文以WD肝纤维化患者作为研究对象，在充分收集临床资料的基础上，运用临床流行病学及数理统计分析方法，开展对WD肝纤维化中医证候学研究，以期揭示WD肝纤维化中医基本证候特征，为深化WD肝纤维化中医治疗提供依据4.2.1WD肝纤维化临床资料的收集临床资料的收集是中医辨证的基础，是中医辨证研究的起始点。在此基础上才能够进行中医证候诊断。目前临床资料的收集可通过以下几个方面来实现：（1）对《内经》以来的古今文献有关的疾病症状描述及记载进行整理,采用手工和计算机检索相结合的方法[24]；（2）直接采用专业协会或专业委员会以及高等医学院校教材的对本病的临床表现的相关论述；（3）来自临床一线第一手资料的调查荟萃。前二者资料收集方式主要是文献的归纳总结和描述，而后者则直接来自临床实践的认知。WD是一种累及多系统的疾病，WD肝纤维化除了肝脏相关见症外，往往还可有全身各个系统见症，使得文献整理的工作面较大，工作量较重。为避免对古今文献整理的盲目性，应用现有的WD的知识去进行文献内容的甄别实属必要。在本病的诊治研究以及有关WD知识传播方面，国际Wilson病协会作为一个专门从事WD研究的国际性组织做了大量工作，其所做的研究成果可作为临床资料收集时的重要参考。高等中医院校教材如《中医诊断学》、《中医内科学》虽无本病的专列章节，但有关本病的相关内容多见于上述教材中，可供借鉴。而在西医本科规划教材《神经病学》中，本病作为常见且重要的锥体外系疾病单独成篇。尽管如此，要取得WD临床症状可靠的第一手资料，提高临床辨证的准确性、权威性、可靠性、科学性和可操作性，严格按临床流行病学方法进行设计和收集是WD临床资料收集乃至辨证研究必须遵循的规则。本文综合应用上述方法进行WD临床资料的采集，在文献调研和临床专家咨询的基础上，开展WD临床流行病学资料调查，内容涉及患者人口学资料、一般情况、现病史、既往史、个人史、家族史及常见中医症状、体征，控制可变因素，同时对调查所得全部资料进行计算机管理和处理，从而保证了临床资料的准确性和可靠性。18 基于Wilson病肝纤维化临床证候特征的肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化免疫组化研究4.2.2WD肝纤维化临床资料的辨证及数理统计分析的应用辨证，是中医诊断疾病的重要内容，是中医防治疾病一贯遵从的基本法则。辨证，从实质上讲，就是分析辨别疾病的证候，在四诊、八纲的基础上将疾病过程中具有规律性的一系列症候进行系统归类，从而识别疾病，探求病因，审察病机，确定病位和疾病发展趋势的一种诊断方法。其基本素材来源于所收集的真实、生动、具体的临床资料，以此作为辨证研究的基础。目前对临床资料所进行的辨证方法主要表现为以下几种形式：一是采用相关疾病全国专业委员会制定的证候标准进行辨证，进一步分析疾病的临床资料；二是汇萃专家的智慧，以专家的经验作为辨证依据，建立相应的辨证标准，据此进行临床资料的辨证；三是应用临床流行病学方法建立初步辨证标准，然后对临床资料进行辨证分析；四是按所收集的原始临床资料中的中医证候进行量化，制定出某一证候的诊断标准。回顾以往制定的各种证候诊断和评价标准，不难看出大多来源于历代文献描述和专家个人的经验，虽不乏深厚的实践积累，但终究带有一定程度的主观偏倚，缺乏现代科学研究方法、技术和数理统计学的支持，不能被普遍采用，同时由于中医证候存在着一定的模糊性，且应用专家经验也很难完全剔除辨证时的主观性，因此，为保证临床资料辨证的准确性，有必要开展证候诊断过程中的方法学研究。根据疾病的症状、体征包括舌脉象结果，采用数理统计方法对上述临床资料进行分析，可以较好的排除上述非客观因素的存在，得出更为贴切的符合临床实际的证候分类及辨证结果。在具体到WD肝纤维化的证候特征研究时，我们引入数理统计方法进行临床资料的整理加工，进行中医临床证候分类及其相关因素分析，从而客观地再现WD肝纤维化的中医证候实质。聚类分析，又称群集分析，是一种探索性分析方法，是研究“物以类聚”的一种多元统计分析方法，它依据的基本原则是：直接比较样本中各事物之间的性质，将性质相近的归为一类，将性质差别较大的归于不同的类，亦即同类的事物差别小，而不同类的事物之间差别较大。聚类分析,对类的数目、类的结构不做任何假定,只在数据中寻找某种“自然的”分类结构。即在自然存在的中医证候状态中,以原始的症状变量“自然”数据资料为出发点,依据各变量、样品之间的相关性程度,进行逐步聚类[25]。在分类的过程中，人们不必事先给出一个分类标准，聚类分析能够从样本数据出发，自动进行分类，较好地排除了人为的主观因素。运用19 第一部分Wilson病肝纤维化临床证候特征研究聚类分析的方法研究症状，能够快速、简捷地做出症状分类,避免了人为划定的局限性,可以为中医证候学研究提供客观化、标准化、数量化的依据,是有效的研究方法之一。本文在WD肝纤维化临床资料收集的基础上，应用聚类分析方法，对WD肝纤维化常见的临床表现进行聚类，结合临床实际，最终确定为五类。判别分析与聚类分析明显不同，判别分析是一种有效的对个案进行分类分析的方法，事先已知组别的特征，并且有一批来自各已知类别的训练样本，根据已知类别的训练样本资料来建立判别函数，再用这种判别函数对未知类别的新对象进行判别归类。当各类临床表现分类还不十分清楚时，一般先用聚类分析进行聚类，然后根据已掌握的分类训练样本建立判别函数，用来判别新对象的分类。这是判别分析的传统作用。近年来，判别分析的作用得到进一步扩展，研究表明，利用判别分析来对聚类分析结果的准确性进行检验具有重要的临床实用价值。聚类分析分成相应的类别后，可作为判别分析的类别进行输入，并作出相应的判断。本文在对WD肝纤维化临床资料进行聚类分析后，又进行判别分析，结果表明WD肝纤维化上述5类证候分类能较好地代表了WD肝纤维化临床证候。4.2.3WD肝纤维化临床证候特征WD肝纤维化病位涉及肝、肾、脾、心四脏；其病变脏腑顺位为肝、肾、脾、心，肝脏累及频次最高；病变性质为虚实夹杂之证，虚主要为肝肾亏虚、脾气亏虚，实主要为痰浊内蕴、瘀阻脉络；证候方面以肝肾亏虚、痰瘀互结证多见；WD肝纤维化中医证候分布与患者年龄和病程有关，与性别无关。4.3基于临床证候特征指导WD治疗基于WD肝纤维化的主要临床表现，结合对大量WD肝纤维化患者长期的临床观察和新安医学医家中关于脑病的理论及丰富的临床经验，杨文明教授创制了中药复方制剂——肝豆扶木汤（GDFMT）。全方由何首乌、枸杞、土茯苓、白芍、三七、郁金及柴胡等中草药组成，其中，何首乌、枸杞补益肝肾、扶正固本而为君药，臣以三七、郁金、土茯苓以活血化瘀、解毒除湿，治疗兼证，佐以白芍、柴胡柔肝敛阴、调达肝气，助君药补肝肾之力。诸药配伍，标本兼治，共奏补益肝肾、豁痰化瘀之效。前期临床研究表明，GDFMT能够明显改善WD肝纤维化患者UWDRS量表肝脏功能积分，降低肝型WD肝纤维化患者中医证候积分，20 基于Wilson病肝纤维化临床证候特征的肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化免疫组化研究能促进患者尿铜排泄，降低血清TIMP-1、TGF-β1和TNF-α的含量，提高血清MMP2、MMP9、ALT和AST的水平，发挥抗肝纤维化作用[7,8]。前期实验研究表明，GDFMT能降低WD模型铜负荷大鼠肝铜及血清铜含量，具有排铜功效，并能降低大鼠肝组织中MDA含量，提高SOD活性，纠正氧化、抗氧化失衡，以预防治疗脂质过氧化[9]；能降低其血清中ALT、AST活力及AST/ALT比值，提高血清TP、ALB水平，减轻WD模型大鼠肝细胞坏死、纤维增生及脂肪变性的程度，发挥显著的保肝作用[10]；通过HE和Masson染色观察发现，其还能有效地改善肝纤维化TX小鼠的肝组织病理[8]。然而，GDFMT抗WD肝纤维化作用的可能分子机制目前尚不十分明了，我们将在下面的实验研究中进一步探讨。21 第二部分肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化免疫组化研究第二部分肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化免疫组化研究1实验材料1.1实验动物及条件美国Jackson实验动物中心TX小鼠（4月龄），饲养于安徽中医药大学省部共建新安医学教育部重点实验室动物房，进行传代繁殖。成年雄性TX小鼠96只，4月龄。正常对照组DL小鼠16只，4月龄。1.2实验药物肝豆扶木汤，方由何首乌、枸杞、土茯苓、白芍、三七、郁金和柴胡等中草药组成，购于安徽中医药大学第一附院药剂科，每剂生药重156g。丹参，购于安徽中医药大学第一附院，每剂生药重30g。青霉胺，规格0.125g/片，上海医药集团有限公司信谊制药总厂生产，批号：H31022286。1.3实验仪器冰箱：合肥荣事达三洋电器公司，型号：BCD-245F；自动脱水机：湖北孝感亚光医用电子技术有限公司，型号：ZT-12M；石蜡包埋机：湖北孝感亚光医用电子技术有限公司，型号：YB-7B；切片机：德国Leica公司，型号：RM2135；切片漂烘仪：安徽合肥市电子科学研究所，型号：科力飞QP-B；纯水仪：香港力康生物医疗科技控股集团，型号：HEALFORCENW10UF；微波炉：广东格兰仕集团有限公司，型号：P7021TP-6；恒温培养箱：上海福玛实验设备有限公司，型号：GHX-9270B-1；干燥箱：上海精宏实验设备有限公司，型号：DHG-9140A；天平：上海精科天平厂，型号：FA1004；搅拌器：常州国华电器有限公司，型号：88-1；生物显微摄像系统：江苏省捷达科技发展有限公司，型号：JD801。1.4实验试剂TGF-β1（ab27969）：英国abcam公司，批号：GR66929-1322 基于Wilson病肝纤维化临床证候特征的肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化免疫组化研究TβRI（bs-0638R）：北京博奥森生物技术有限公司，批号：151124TβRII（BS1696）：美国Bioworld公司，批号：CN162855Smad2（ab63576）：英国abcam公司，批号：CN66141Smad3（ab40854）：英国abcam公司，批号：AA56133Smad4（BS7225）：美国Bioworld公司，批号：AA58442Smad7（bs-0566R）：北京博奥森生物技术有限公司，批号：AD105265通用型二抗试剂盒（PV-6000）：北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：K1155922DDAB显色剂（ZLI-9018）：北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：K152317J2实验方法2.1实验分组96只雄性TX小鼠随机分为模型组（生理盐水）、青霉胺组（青霉胺）、丹参组（丹参）、GDFMT低剂量组（简称低剂量组）、GDFMT中剂量组（简称中剂量组）、GDFMT高剂量组（简称高剂量组）。另设正常对照组DL小鼠16只，共7组。2.2给药方法模型组用等量生理盐水灌胃；正常对照组用等量生理盐水灌胃；青霉胺组研成粉剂，用蒸馏水配成混悬液按0.1g·kg-1·d-1(按临床等效量计算)进行灌胃；丹参组用蒸馏水配成混悬液按3g·kg-1·d-1(按临床等效量计算)进行灌胃；高、中、低剂量组小鼠予以GDFMT灌胃处理，中剂量组给药15.6g·kg-1·d-1(按临床等效量计算)，高、中、低剂量组按4：2：1浓度给药。各组灌胃均每天1次，连续28天。2.3标本提取于灌胃后2、4周结束时分批处死动物，每组每次8只。小鼠眼眶静脉丛取血后剖开腹腔，剪取肝脏，4°C生理盐水冲洗以去除薄膜和残留组织，取小鼠部分肝右叶，浸泡于10%中性福尔马林固定24h，石蜡包埋，做免疫组织化学染色。2.4检测指标及方法2.4.1实验小鼠一般情况观察观察灌胃前后，小鼠摄食、进水、毛色、体重及精神活动等一般情况。23 第二部分肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化免疫组化研究2.4.2免疫组化SP法检测肝组织TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2、Smad3、Smad4和Smad7蛋白的表达采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法（SP法）进行免疫组化染色，操作步骤如下：⑴制备石蜡切片（厚度4μm），放入70℃烤箱烤片1h；⑵常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水：二甲苯I、II、III脱蜡各10min；无水乙醇I、II、III各5min；95%乙醇I、II各2min；80%乙醇2min；⑶自来水、蒸馏水冲洗各20s，放入PBS缓冲液中洗涤3min×3次，洗涤一定要充分；⑷高温高压法组织修复：待高压锅内EDTApH8.0修复液沸腾后放入切片，盖紧高压锅盖，待高压锅阀门喷气开始计时，修复3min；⑸待高压锅停止喷气后用流水冲洗高压锅以降温，室内放置10-20min；⑹切片取出后放入PBS缓冲液中洗涤3min×3次；⑺放入3%H2O2水溶液中5-10min，以去除内源性过氧化物酶；⑻放入PBS缓冲液中洗涤3min×3次；⑼取出切片，甩干组织周围液体后滴加一抗，注意保持组织湿润状态但表面不能有液体，抗体要全部覆盖组织而且不能有气泡，使抗体能全部与组织接触；⑽滴加一抗后放入专用孵育盒内4℃冰箱过夜；⑾甩掉一抗，切片放入PBS缓冲液中洗涤3min×3次，充分洗涤，防止因一抗洗涤不净引起的非特异性染色；⑿滴加聚合物增强剂（基本要求同一抗），室温孵育15-20min；⒀切片放入PBS缓冲液中洗涤3min×3次，充分洗涤，防止因洗涤不净引起的非特异性染色；⒁滴加辣根酶标记聚合物（基本要求同一抗），室温孵育15-20min；⒂切片放入PBS缓冲液中洗涤3min×3次，充分洗涤，防止因洗涤不净引起的非特异性染色；⒃DAB显色，显色时间5min左右，如显色时间太短，阳性强度不够，阳性部位不突出，如显色时间过长，背景着色较深，阳性部位对比差；24 基于Wilson病肝纤维化临床证候特征的肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化免疫组化研究⒄苏木素复染细胞核30s；⒅分化、返蓝；⒆梯度酒精脱水，脱水要彻底；⒇二甲苯透明，中性树胶封片，不能有气泡，以免影响镜下观察。结果判定：采用JD801形态学显微图像分析系统进行图像半定量分析，切片在光镜下按照统一放大倍数（10×40）照相并进行分析，每张切片随机摄取5个视野，测定细胞中棕黄色阳性表达颗粒的平均光密度值（OD），代表各蛋白的表达水平。2.5统计学方法所有数据运用SPSS17.0软件进行统计分析。计量资料比较用均数±标准差（x±s）表示；多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）；两组间比较采用LSD或Dunnett-t检验，进行方差齐性检验，若方差齐采用LSD检验，方差不齐采用Dunnett-t检验。若P<0.05为有显著差异，P<0.01为有极显著差异，P>0.05无统计学意义。3实验结果3.1小鼠一般情况观察正常组小鼠毛色光亮，饮食进水正常，体重正常增长，精神活动正常，无死亡。模型组小鼠饮食进水减少，毛色无光，尿色深黄，精神稍显亢奋，鼠尾可见瘀点瘀斑，有鼻出血现象。GDFMT组、丹参组及青霉胺组治疗2周后摄食、进水、毛色、精神状态及鼠尾的瘀点瘀斑均有改善，以GDFMT高剂量组改善最为明显，且随灌胃时间延长，效果显著，4周较2周明显改善。3.2小鼠肝组织中TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2、Smad3、Smad4及Smad7蛋白免疫组化染色的观察TGF-β1的免疫组化染色以细胞质和（或）细胞膜上出现棕黄色颗粒为阳性；而TβRI、TβRII、Smad2、Smad3、Smad4及Smad7以细胞质内出现棕黄色颗粒为阳性。镜下400倍任取5个视野，拍照后用图像分析系统进行图像半定量分析，测得每个组织片上各蛋白的平均光密度值（OD）。25 第二部分肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化免疫组化研究3.3免疫组化SP法检测GDFMT对TX小鼠肝纤维化肝组织TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7蛋白表达的影响治疗2周和治疗4周后均可见如下结果。与正常组比较，模型组TGF-β1、TβRI、TβRII、Smad2、Smad3和Smad4蛋白的表达明显升高，Smad7蛋白的表达明显降低(P<0.01)。与模型组比较，各治疗组TGF-β1、TβRI、TβRII、Smad2、Smad3和Smad4蛋白表达均降低，Smad7蛋白表达则升高(P<0.05，P<0.01)。与丹参组、青霉胺组及低、中剂量组比较，高剂量组TGF-β1、TβRI、TβRII、Smad2、Smad3和Smad4蛋白表达明显降低，Smad7蛋白的表达则明显升高(P<0.01)，表明高剂量组对上述指标的干预作用优于其他各组。与青霉胺组及低剂量组比较，丹参组和中剂量组TGF-β1、TβRI、TβRII、Smad2、Smad3和Smad4蛋白表达均明显降低，Smad7蛋白的表达明显升高(P<0.05，P<0.01)，表明丹参组和中剂量组对上述指标的干预作用优于青霉胺组和低剂量组；而丹参组与中剂量组的比较差异无统计学意义(P>0.05)。与低剂量组比较，青霉胺组TGF-β1、TβRI、TβRII、Smad2、Smad3和Smad4蛋白的表达降低，Smad7蛋白的表达升高(P<0.05，P<0.01)，表明青霉胺组对上述指标的干预作用优于低剂量组。与治疗2周结果比较，各治疗组在治疗4周结束TGF-β1、TβRI、TβRII、Smad2、Smad3和Smad4蛋白表达均降低，Smad7蛋白表达则升高(P<0.05，P<0.01)，表明各治疗药物对上述指标的干预作用呈时间依赖性，随治疗时间的延长，干预作用增强。详见表7-10，图2-16。26 基于Wilson病肝纤维化临床证候特征的肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化免疫组化研究表7小鼠肝组织TGF-β1、TβRI蛋白表达（x±s）Tab7TheexpressionofTGF-β1andTβRIinlivertissueofmice（x±s）TGF-β1TβRI组别n2周4周2周4周正常组80.40±0.030.39±0.020.38±0.030.38±0.03模型组81.17±0.10**1.18±0.10**1.21±0.09**1.21±0.13**高剂量组80.67±00.81.02##0.55±0.03##▲▲0.63±0.04##0.50±0.04##▲▲中剂量组80.81±0.03##△△cbb0.69±0.04##△△cbb▲▲0.83±0.04##△△cbb0.70±0.04##△△cbb▲▲低剂量组81.01±0.04##△△aabb0.81±0.04##△△aab▲▲1.07±0.06##△△aab0.86±0.04##△△aab▲▲丹参组80.81±0.01##△△0.71±0.02##△△▲▲0.84±0.03##△△0.69±0.04##△△▲▲青霉胺组80.94±0.01##△△aa0.77±0.03##△△a▲▲1.01±0.04##△△aa0.81±0.05##△△aa▲▲注：与正常组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01；与高剂量组比较，△△P<0.01；与丹参组比较，aP<0.05，aaP<0.01,cP>0.05；与青霉胺组比较，bP<0.05，bbP<0.01；与治疗2周结果比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01。表8小鼠肝组织TβRII、Smad2蛋白表达（x±s）Tab8TheexpressionofTβRIIandSmad2inlivertissueofmice（x±s）TβRIISmad2组别n2周4周2周4周正常组80.49±0.080.49±0.070.43±0.020.43±0.02模型组81.15±0.06**1.16±0.07**1.23±0.16**1.23±0.14**高剂量组80.65±0.04##0.55±0.04##▲▲0.68±0.03##0.52±0.03##▲▲中剂量组80.82±0.04##△△cbb0.69±0.04##△△cbb▲▲0.82±0.03##△△cbb0.73±0.03##△△cbb▲低剂量组80.99±0.08#△△aab0.83±0.03##△△aab▲▲1.08±0.09#△△aabb0.85±0.03##△△aab▲▲丹参组80.83±0.04##△△0.70±0.05##△△▲▲0.82±0.04##△△0.74±0.03##△△▲青霉胺组80.93±0.05##△△aa0.79±0.05##△△a▲▲0.98±0.04##△△aa0.80±0.03##△△a▲▲注：与正常组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01；与高剂量组比较，△△P<0.01；与丹参组比较，aP<0.05，aaP<0.01,cP>0.05；与青霉胺组比较，bP<0.05，bbP<0.01；与治疗2周结果比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01。27 第二部分肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化免疫组化研究表9小鼠肝组织Smad3、Smad4蛋白表达（x±s）Tab9TheexpressionofSmad3andSmad4inlivertissueofmice（x±s）Smad3Smad4组别n2周4周2周4周正常组80.45±0.040.44±0.030.44±0.010.44±0.03模型组81.20±0.10**1.21±0.10**1.23±0.12**1.22±0.08**高剂量组80.62±0.01##0.52±0.02##▲▲0.71±0.02##0.59±0.03##▲▲中剂量组80.82±0.03##△△cbb0.71±0.04##△△cbb▲▲0.87±0.03##△△cbb0.70±0.03##△△cbb▲▲低剂量组81.04±0.04##△△aab0.86±0.04##△△aab▲▲1.11±0.06##△△aab0.89±0.02##△△aab▲▲丹参组80.83±0.01##△△0.73±0.02##△△▲▲0.86±0.04##△△0.71±0.02##△△▲▲青霉胺组80.99±0.01##△△aa0.81±0.03##△△aa▲▲1.05±0.03##△△aa0.83±0.04##△△aa▲▲注：与正常组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01；与高剂量组比较，△△P<0.01；与丹参组比较，aP<0.05，aaP<0.01,cP>0.05；与青霉胺组比较，bP<0.05，bbP<0.01；与治疗2周结果比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01。表10小鼠肝组织Smad7蛋白表达（x±s）Tab10TheexpressionofSmad7inlivertissueofmice（x±s）Smad7组别n2周4周正常组81.13±0.061.12±0.07模型组80.41±0.06**0.41±0.07**高剂量组80.83±0.04##0.95±0.07##▲▲中剂量组80.68±0.04##△△cbb0.82±0.03##△△cbb▲▲低剂量组80.51±0.05##△△aab0.66±0.04##△△aab▲▲丹参组80.67±0.04##△△0.80±0.05##△△▲▲青霉胺组80.56±0.03##△△aa0.70±0.08##△△aa▲▲注：与正常组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01；与高剂量组比较，△△P<0.01；与丹参组比较，aP<0.05，aaP<0.01,cP>0.05；与青霉胺组比较，bP<0.05，bbP<0.01；与治疗2周结果比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01。28 基于Wilson病肝纤维化临床证候特征的肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化免疫组化研究29 第二部分肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化免疫组化研究图2小鼠肝组织TGF-β1、TβRI、TβRII、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7蛋白表达（x±s）Fig2TheexpressionofTGF-β1、TβRI、TβRII、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7inlivertissueofmice（x±s）30 基于Wilson病肝纤维化临床证候特征的肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化免疫组化研究ABCDEFG注：A:正常组，B:模型组，C:GDFMT高剂量组，D:GDFMT中剂量组，E:GDFMT低剂量组，F:丹参组，G:青霉胺组图3小鼠治疗2周肝组织TGF-β1蛋白表达（免疫组化染色×400）Fig3TGF-β1expressioninlivertissueofmiceaftertreating2weeks（immunocytochemistrystain×400）.31 第二部分肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化免疫组化研究ABCDEFG注：A:正常组，B:模型组，C:GDFMT高剂量组，D:GDFMT中剂量组，E:GDFMT低剂量组，F:丹参组，G:青霉胺组图4小鼠治疗4周肝组织TGF-β1蛋白表达（免疫组化染色×400）Fig4TGF-β1expressioninlivertissueofmiceaftertreating4weeks（immunocytochemistrystain×400）.32 基于Wilson病肝纤维化临床证候特征的肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化免疫组化研究ABCDEFG注：A:正常组，B:模型组，C:GDFMT高剂量组，D:GDFMT中剂量组，E:GDFMT低剂量组，F:丹参组，G:青霉胺组图5小鼠治疗2周肝组织TβRI蛋白表达（免疫组化染色×400）Fig5TβRIexpressioninlivertissueofmiceaftertreating2weeks（immunocytochemistrystain×400）.33 第二部分肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化免疫组化研究ABCDEFG注：A:正常组，B:模型组，C:GDFMT高剂量组，D:GDFMT中剂量组，E:GDFMT低剂量组，F:丹参组，G:青霉胺组图6小鼠治疗4周肝组织TβRI蛋白表达（免疫组化染色×400）Fig6TβRIexpressioninlivertissueofmiceaftertreating4weeks（immunocytochemistrystain×400）.34 基于Wilson病肝纤维化临床证候特征的肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化免疫组化研究ABCDEFG注：A:正常组，B:模型组，C:GDFMT高剂量组，D:GDFMT中剂量组，E:GDFMT低剂量组，F:丹参组，G:青霉胺组图7小鼠治疗2周肝组织TβRII蛋白表达（免疫组化染色×400）Fig7TβRIIexpressioninlivertissueofmiceaftertreating2weeks（immunocytochemistrystain×400）.35 第二部分肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化免疫组化研究ABCDEFG注：A:正常组，B:模型组，C:GDFMT高剂量组，D:GDFMT中剂量组，E:GDFMT低剂量组，F:丹参组，G:青霉胺组图8小鼠治疗4周肝组织TβRII蛋白表达（免疫组化染色×400）Fig8TβRIIexpressioninlivertissueofmiceaftertreating4weeks（immunocytochemistrystain×400）.36 基于Wilson病肝纤维化临床证候特征的肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化免疫组化研究ABCDEFG注：A:正常组，B:模型组，C:GDFMT高剂量组，D:GDFMT中剂量组，E:GDFMT低剂量组，F:丹参组，G:青霉胺组图9小鼠治疗2周肝组织Smad2蛋白表达（免疫组化染色×400）Fig9Smad2expressioninlivertissueofmiceaftertreating2weeks（immunocytochemistrystain×400）.37 第二部分肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化免疫组化研究ABCDEFG注：A:正常组，B:模型组，C:GDFMT高剂量组，D:GDFMT中剂量组，E:GDFMT低剂量组，F:丹参组，G:青霉胺组图10小鼠治疗4周肝组织Smad2蛋白表达（免疫组化染色×400）Fig10Smad2expressioninlivertissueofmiceaftertreating4weeks（immunocytochemistrystain×400）.38 基于Wilson病肝纤维化临床证候特征的肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化免疫组化研究ABCDEFG注：A:正常组，B:模型组，C:GDFMT高剂量组，D:GDFMT中剂量组，E:GDFMT低剂量组，F:丹参组，G:青霉胺组图11小鼠治疗2周肝组织Smad3蛋白表达（免疫组化染色×400）Fig11Smad3expressioninlivertissueofmiceaftertreating2weeks（immunocytochemistrystain×400）.39 第二部分肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化免疫组化研究ABCDEFG注：A:正常组，B:模型组，C:GDFMT高剂量组，D:GDFMT中剂量组，E:GDFMT低剂量组，F:丹参组，G:青霉胺组图12小鼠治疗4周肝组织Smad3蛋白表达（免疫组化染色×400）Fig12Smad3expressioninlivertissueofmiceaftertreating4weeks（immunocytochemistrystain×400）.40 基于Wilson病肝纤维化临床证候特征的肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化免疫组化研究ABCDEFG注：A:正常组，B:模型组，C:GDFMT高剂量组，D:GDFMT中剂量组，E:GDFMT低剂量组，F:丹参组，G:青霉胺组图13小鼠治疗2周肝组织Smad4蛋白表达（免疫组化染色×400）Fig13Smad4expressioninlivertissueofmiceaftertreating2weeks（immunocytochemistrystain×400）.41 第二部分肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化免疫组化研究ABCDEFG注：A:正常组，B:模型组，C:GDFMT高剂量组，D:GDFMT中剂量组，E:GDFMT低剂量组，F:丹参组，G:青霉胺组图14小鼠治疗4周肝组织Smad4蛋白表达（免疫组化染色×400）Fig14Smad4expressioninlivertissueofmiceaftertreating4weeks（immunocytochemistrystain×400）.42 基于Wilson病肝纤维化临床证候特征的肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化免疫组化研究ABCDEFG注：A:正常组，B:模型组，C:GDFMT高剂量组，D:GDFMT中剂量组，E:GDFMT低剂量组，F:丹参组，G:青霉胺组图15小鼠治疗2周肝组织Smad7蛋白表达（免疫组化染色×400）Fig15Smad7expressioninlivertissueofmiceaftertreating2weeks（immunocytochemistrystain×400）.43 第二部分肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化免疫组化研究ABCDEFG注：A:正常组，B:模型组，C:GDFMT高剂量组，D:GDFMT中剂量组，E:GDFMT低剂量组，F:丹参组，G:青霉胺组图16小鼠治疗4周肝组织Smad7蛋白表达（免疫组化染色×400）Fig16Smad7expressioninlivertissueofmiceaftertreating4weeks（immunocytochemistrystain×400）.44 基于Wilson病肝纤维化临床证候特征的肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化免疫组化研究4.讨论4.1WD模型TX(toxicmilk)小鼠TX小鼠是由同系繁殖到F68的DL小鼠所产生的自然突变品系，最早出现于1974年，其致病基因与Wilson病患者致病基因——ATP7B基因的同源性达82%[26]。研究显示，TX小鼠的铜生化特征表现为：血清Cu和CP的含量明显降低，仅为正常的1/3左右；器官尤其是肝组织存在大量Cu沉积。用光学显微镜常规HE染色及电镜观察TX小鼠肝脏病理学特点，光镜下肝细胞排列紊乱、细胞肿胀，部分胞核增大呈空泡状，并伴有大量炎性细胞浸润，同时可见到活跃增生的肝卵圆细胞。电镜下，多数肝细胞的溶酶体结构有较多颗粒状电子致密物沉积，并伴有线粒体增多肿胀[27]。由此可见，TX小鼠与临床所见Wilson病患者有着相似的遗传背景、铜生化特征及病理特点，是Wilson病研究较为理想的动物模型。但作为一种自然突变品系，TX小鼠在生命的不同时期，其肝损害和铜代谢障碍的水平不同。研究显示，TX小鼠自第2月开始出现肝组织铜沉积，至第4月达到高峰，铜蓝蛋白活性的改变及肝脏病理损害均在第4月时最为显著。TX小鼠作为Wilson病研究的模型鼠，症状前治疗的探索建议选用1月龄小鼠，出现临床症状后的治疗建议选用2月龄小鼠，而病情高峰时期的研究可考虑选用4月龄小鼠[28]。因而在本研究中，我们选用4月龄的TX小鼠，以期最大程度复制临床Wilson病模型。4.2TGF-β1/Smad信号传导通路蛋白与肝纤维化TGF-β是目前公认最强的能激活Hsc并促进其表达ECM的关键因子，在肝纤维化病变过程中起重要作用。它是一类由TGF-β（5种异体）、激活素、抑制素和骨形态发生蛋白等30多种细胞因子组成的超家族，其中，TGF-β1在细胞和组织中最为丰富，一般情况下，我们所说的TGF-β即是指TGF-β1分子[29,30]。正常肝脏实质细胞与内皮细胞不表达TGF-β1，肝损伤时，骨髓来源的巨噬细胞、Kupffer细胞、肝细胞及血小板生成大量的TGF-β1，能促进Hsc合成胶原、蛋白多糖、纤维连接蛋白等细胞外基质，使Hsc分泌金属蛋白酶组织抑制物增多，降解蛋白酶合成减少，阻止新合成细胞基质的分解，减少ECM的降解，使ECM合成与降解平衡打破，ECM沉积增多，肝纤维化逐渐加重[31]。而活化的Hsc又能通过自分泌、旁分泌合成大量TGF-β1，使其水平持续增高，形成恶性循环。正常45 第二部分肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化免疫组化研究肝脏TGF-β1的转录见于门静脉周围细胞、肝小叶中央静脉周围细胞、导管周围细胞和肝包膜间质细胞，肝纤维化时转录明显增加[32]。研究表明，许多中药及其复方制剂能抑制TGF-β1的生成和激活，是一种很有希望的抗肝纤维化措施。林远灿等[33]发现，垂盆草总黄酮能下调肝组织中TGF-β1蛋白和mRNA表达，有效逆转实验性大鼠肝纤维化。普显宏等[34]探讨三七皂苷R1对肝纤维化模型大鼠的作用，发现其可降低肝组织中TGF-β1信号的表达，减轻肝细胞的纤维化，发挥保护肝组织损伤的作用。尚立芝等[35]实验研究表明，柴胡疏肝散有明显的抗肝纤维化作用，其机制可能与抑制TGF-β1信号表达有关。TGF-β受体（TβR）是在细胞膜表面与TGF-β高亲和力结合蛋白，TGF-β1与特异性膜受体结合后，其生物信号才能通过下游Smads蛋白下传，进而将生物信息向细胞内传导，激活靶细胞发挥生物学效应。TβR存在3种类型：TβRI、TβRII和TβRIII，其中，TβRI和TβRII具有丝/苏氨酸（Ser/Thr）蛋白激酶活性，与细胞内通讯有关。TGF-β1先与细胞膜表面的TβRII结合形成复合物，构型发生变化，能够被TβRI识别并结合，形成TβRII-TGF-β1-TβRI三聚体复合物，从而与Smads蛋白作用，参与信号转导[36]。因而，阻断TGF-β1与特异性膜受体结合，亦可作为一种有效抑制肝纤维化的途径。吴义春等[37]发现，护肝片能显著抑制肝纤维化肝组织Hsc的活化、增殖，抑制TβRImRNA的表达，这可能是其抗肝纤维化作用的靶点之一。林寿宁等[38]研究表明，壮肝逐瘀煎能显著改善肝纤维化大鼠肝组织的病理变化，可能通过抑制TβRI/IImRNA的表达发挥抗肝纤维化作用。Smads蛋白是目前所知最重要的TβR胞内激酶的底物，能将配体与受体作用的信号从胞浆传导到胞核，介导TGF-β1的胞内信号转导[39]。目前发现脊椎动物至少有8种不同的Smad成员，根据其不同的结构和功能可分为3类：⑴受体调节型Smads（R-Smads），主要有Smad1、2、3、5、8，其中，由TGF-β1激活的有Smad2和Smad3，是TβRI胞内激酶的特异底物，与信号通路的特异性相关；⑵通用型Smad（Co-Smad），目前只有Smad4，能与其他型Smads结合形成稳定的异源多聚体，转运至细胞核内激活转录应答，是TGF-β家族信号转导共同需要的介质；⑶抑制型Smads（I-Smads），有Smad6和Smad7，主要起负性调节作用，Smad7能够竞争性占据TβRI，使其不能磷酸化Smad2和Smad3，从而起到阻止TGF-β1信号转导的作用。实验研究发现，急性肝损伤时，TGF-β1能迅速诱46 基于Wilson病肝纤维化临床证候特征的肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化免疫组化研究导Smad7表达，使Hsc内TGF-β1/Smad信号转导通路呈动态平衡状态，不致大量胶原产生[40]。慢性肝损伤时，R-Smads持续被磷酸化，活化的Hsc丧失了TGF-β1诱导Smad7表达上调的敏感性，致使R-Smads不能被Smad7所抑制，从而引起大量ECM堆积，促发肝纤维化。王桂杰等[41]研究表明，复方中药制剂软肝宁可能通过抑制肝内TGF-β1、Smad2/3的表达，有效逆转CCl4诱导肝纤维化大鼠的纤维化。卢凤美等[42]研究表明，红景天可显著抑制肝脏Smad4表达，促进Smad7的表达，从而减弱由TGF-β1介导的肝纤维化信号，发挥抗肝纤维化作用。4.3肝豆扶木汤分析何首乌：又称首乌、赤首乌，来源于蓼科植物何首乌PolygonummultiflorumThunb.的块根，始载于宋朝的《日华子本草》。其性微温，味甘、苦、涩，归肝肾二经，生用可解毒消痈、截疟、润肠通便，主治瘰疡疮痈、皮肤瘙痒、肠燥便秘；制首乌能补益精血，用治精血亏虚、面色萎黄、头晕眼花、失眠健忘、须发早白、腰膝酸软等病症[43-45]。现代研究表明，何首乌含二苯乙烯苷、蒽醌类、聚合原花青素、磷脂化合物及微量元素等多种化学成分，具有降血脂、延缓动脉粥样硬化、保肝、提高免疫力、抗衰老和益智等作用[44,45]。其中，二苯乙烯苷是保肝的主要有效成分，有研究表明，其对甘油三酯、胆固醇的合成、分解和转运的多个关键酶及关键蛋白均具有良好的调控作用，具有很好的降脂活性[46]。熊章鄂等[47]的研究表明，二苯乙烯苷对小鼠急性酒精性肝损伤具有很好的保护作用，作用机制可能是通过抑制内毒素引起的Kupffer细胞激活，从而抑制下游核因子NF-κB的激活，减少炎性反应的级联放大触发机制，从而保护肝功能。何首乌所含的蒽醌类化合物主要有大黄素、大黄酸、大黄酚、人黄素甲醚及大黄苷[44]。实验研究发现，大黄素能改善四氯化碳诱导的肝纤维化大鼠肝功能，并降低HA、LN水平，从而发挥保肝、抗肝纤维化作用，其机制可能与上调Smad7、下调Smad3mRNA和蛋白的表达、下调α-SMA蛋白表达，进而抑制肝星状细胞活化有关[48-50]。大黄酸亦具有保肝和抗肝纤维化作用，可能与抗炎、抗氧化、抑制TGFβ1的活性、抑制肝星状细胞活化有关[51]。何首乌具有良好的保肝、抗肝纤维化作用，但近年来有关服用后出现药物性肝炎等肝损害的报道屡见不鲜，受到大家的广泛关注。何首乌的毒性与炮制方法、47 第二部分肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化免疫组化研究给药剂量、给药方式、合并用药及特异体质密切相关[52]。涂灿等[53]对比何首乌炮制前后对大鼠肝功能血清学、肝组织病理形态学影响，结果发现，同生何首乌组相比，制何首乌组血清各项指标变化不显，肝组织基本正常，未见病变现象，提示炮制能有效降低何首乌的肝毒性。胡锡琴等[54]的研究表明，何首乌对大鼠肝损害程度与剂量大小有一定相关性，单味药临床用量6-12g范围内，长期服用比较安全，基本无毒副作用；其引起的损伤亦为可逆性损伤，停药后可逐渐恢复正常。在服用何首乌制剂时配伍莱菔子[52]或饮酒[55]均有引起肝损害可能，应注意避免。在应用何首乌时配伍小剂量茯苓有一定的减毒作用，而何首乌多糖与枸杞多糖混合物具有一定的保护肝肾的作用[55]。肝豆扶木汤所用为制首乌，口服用量不超过12g/d，并配伍枸杞、土茯苓，在应用过程中观察未出现肝毒性不良反应。枸杞：又称枸杞子、红耳坠、却老子，是茄科植物宁夏枸杞LyciumbarbarumL.的成熟果实，早在《神农本草经》中便有记载。其味甘、性平，归肝肾二经，具有补肝益肾、益精明目之效，《本草纲目》谓之“补肾、润肺、生精、益气”，《药性论》谓之“补益精，诸不足，易颜色，变白，明目……令人长寿”。常用于肝肾亏虚、精血不足所致的腰膝酸软、眩晕耳鸣、目眩不明、内热消渴、虚劳精亏等病症[56,57]。现代医学研究证实，枸杞对免疫有促进调节作用，能促进造血功能，显著升高白细胞，还有抗衰老、抗突变、抗肿瘤、保肝及抗脂肪肝等多方面作用，临床广泛应用。宁夏枸杞的化学成分主要有枸杞多糖、甜菜碱、类胡萝卜素、类胡萝卜素酯、多种氨基酸及微量元素等[57]。其中，枸杞多糖为主要活性成分[58]，对肝损伤有很好的保护修复作用。实验研究表明，枸杞粗多糖多次灌胃给药，能明显抑制四氯化碳所致肝损伤小鼠ALT的升高，增加肝糖原的含量，并能明显降低肝脏中丙二醛的含量，对正常小鼠亦具有明显的利胆和促进部分肝切除后肝脏再生作用[59]。古赛等[60]的研究表明，枸杞多糖能减轻脂质过氧化反应，通过抑制CYP2E1基因和蛋白的表达，降低血清转氨酶含量，提高谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶活性，增加还原型谷胱甘肽含量，减少丙二醛产生，从而明显改善酒精所致大鼠肝脏脂肪病变。枸杞中另一化学成分甜菜碱亦能通过抗脂质过氧化及增加脂质代谢，发挥保肝及抗脂肪肝作用[61]。而最近的研究表明，甜菜碱能够抑制复合致病因素诱导的大鼠肝纤维化，其作用可能与降低大鼠体内高同型半48 基于Wilson病肝纤维化临床证候特征的肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化免疫组化研究胱氨酸、调节炎性细胞因子和氧化应激有关[62]。三七：又名田七、滇七、金不换等，早在《本草纲目》前的《医门秘旨》、《跌损妙方》中便有记载，为五加科植物三七Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥块根，其性温，味甘、微苦，主归肝胃二经，有化瘀止血、活血定痛之效，主治各种出血证、跌打损伤、瘀血肿痛，且有补虚强壮的作用。所谓“止中有散，能行滞通脉，化瘀生新，止血不留瘀，活血不伤正”。《中国医药大辞典》中有载：“三七功用补血、去瘀损、止血衄，能通能补，功效最良，是方药中之最珍贵者”[63]。现代研究表明，三七含有三七总皂甙(PNS)、三七素（三七氨酸）、黄酮、氨基酸、糖类、挥发油等多种有效成分[64]，具有止血、保护脑组织、保护心肌细胞、调脂、抗血栓、抗炎、增强免疫、抗纤维化、抗肿瘤、抗氧化、清除自由基等作用[63]。其中PNS为三七水溶性成分的主要活性成分，亦是保肝、抗肝纤维化、防治肝癌的主要活性成分。实验研究发现，PNS能明显改善四氯化碳致肝纤维化大鼠的肝功能，降低血清HA、PCIII含量，降低肝组织羟脯氨酸，从而减轻贮脂细胞增生及胶原沉积；可显著上调基质金属蛋白酶-13（MMP-13）、抑制基质金属蛋白酶抑制因子-1（TIMP-1）的表达，促进胶原降解；可通过上调Bcl-2的表达、下调Bax的表达，抑制肝细胞的凋亡；还能显著抑制肿瘤坏死因子-α(TNFα)、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)、核因子NF-κB、转化生长因子-β(TGF-β)及Smad3的表达，升高白细胞介素-10(IL-10)的水平，从而下调促炎因子、上调抑炎因子的产生，发挥抗肝纤维化作用[65-69]。尚西亮等[70]的研究发现，PNS可抑制人肝癌细胞SMMC-7721增殖，促进细胞凋亡，使其生长阻滞于G0/G1期，同时上调、恢复细胞的缝隙连接细胞间通讯作用，发挥抗肿瘤功能。土茯苓：是百合科植物光叶菝葜SmilaxglabraRoxb.的干燥块茎，最早在《名医别录》中便有记载，名禹余粮，《本草纲目》始称其为土茯苓。其性平，味甘、淡，归肝胃二经，具清热解毒、除湿、通利关节之效，主治杨梅毒疮、肢体拘挛、湿疹瘙痒、淋浊带下及痈肿疮毒等病症[71,72]。现代研究表明，土茯苓含有糖类、有机酸类、苯丙素类、甾醇类、皂苷类、挥发油、黄酮及黄酮苷类等多种化学成分，具有抗动脉粥样硬化、抗血栓、抗心肌缺血、抗氧化、保肝、抗炎、镇痛、免疫抑制、利尿、抗胃溃疡、抗肿瘤和抗49 第二部分肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化免疫组化研究菌等作用[72-73]，广泛作为单药、复方应用于临床。目前，对于土茯苓的保肝作用研究不多，对作用机制研究的深度与广度不足，一些临床证实的疗效尚缺乏科学理论的支持。辛淮生等[74]的研究发现，土茯苓水煎剂对大鼠的实验性肝损伤具有保护作用，它能明显拮抗硫代乙酰胺中毒大鼠中毒性肝细胞坏死后5种血清肝酶谱的升高。邓勤智等[75]的研究表明，土茯苓组方可提高乙型肝炎病毒慢加急性肝衰竭患者的好转率，改善临床症状、肝功能及6个月内的生存率。郁金：出自《药性论》，为姜科植物温郁金CurcumawenyujinY.H.ChenetC.Ling、姜黄Curcuma.LongaL.、广西莪术Curcuma.KwangsiensisS.G.LeeetC.F.Liang或蓬莪术Curcuma.phaeocaulisVal.的块根，因产地不同而有温郁金、黄丝郁金、绿丝郁金、桂郁金之分。其性寒，味辛、苦，归肝、胆、心经，具有活血止痛、行气解郁、利胆退黄、清心凉血之效，常用于治疗气滞血瘀诸痛证、热陷心包之神昏、气火上逆出血证、肝胆湿热黄疸等[76]。现代研究表明，郁金含有姜黄素类、挥发油、多糖及微量元素、脂肪油、生物碱等多种化学成分[77]，具有保护肝细胞，促进肝细胞再生，抗癌，抗菌，抗氧化、抗病毒等作用[78]。在保肝作用方面，郁金水煎剂能抑制肝组织细胞因子IL-1β、IL-2、IL-4、IL-18、TNF-α、NF-κB的表达，下调凋亡基因P53、caspase-3的表达，通过调节小鼠肝脏的免疫功能、抗凋亡而减轻四氯化碳所致的急性肝损伤[79-81]。在抗肝纤维化作用方面，实验研究表明，广西桂郁金能降低肝纤维化大鼠肝组织中羟脯氨酸(Hyp)、MDA的含量，增加SOD、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的含量，具备良好的抗脂质过氧化作用，能清除自由基、抗肝损伤[82]；能降低肝纤维化大鼠血清ALT、AST、GLB水平，提高ALB水平，降低HA、LN、PCIII含量而发挥抗肝纤维化作用[83]。彭岳等的研究发现，桂郁金提取物能够抑制人肝星状细胞株(HSC-LX2)细胞增殖，阻止细胞进入DNA合成增殖周期，诱导细胞发生凋亡[84]；能抑制HSC-LX2细胞分泌Ⅰ型、Ⅲ型胶原，并增加其分泌MMP-1和MMP-13的能力[85]，从而干预肝纤维化的病程。白芍：又称白花芍药，是毛莨科芍药属植物PaeonialactifloraPall.的根，始载于《神农本草经》。其性微寒，味苦、酸，归肝脾二经，有养血敛阴、柔肝缓急、平肝潜阳、清泄肝热之效，主治肝血亏虚之月经不调、肝脾不和之胸胁脘腹疼痛、四肢挛急疼痛、肝阳上亢之头痛眩晕等病症[86]。50 基于Wilson病肝纤维化临床证候特征的肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化免疫组化研究现代研究表明，白芍含有单萜及其苷类（包括芍药苷、羟基芍药苷、芍药内酯苷等，统称白芍总苷）、三萜类、黄酮、鞣质类及多糖、挥发油等多种化学成分，有抗炎、保肝、镇痛、解痉和免疫调节等作用[87]。其中，白芍总苷（TGP）是保肝、抗肝纤维化的主要有效成分。在保肝方面，TGP对实验性大鼠酒精性肝损伤有保护作用，能降低大鼠血清中ALT、AST、γ-GT、MDA水平，增加SOD活性，可能通过降低脂质过氧化水平、提高抗氧化酶活性、抑制核因子NF-κB的活化而发挥作用[88]。有研究表明，TGP对四氯化碳致大鼠肝纤维化有较好的治疗作用，其机制与降低肝星状细胞（HSC）分泌HA和PCIII，促进HSC凋亡有关[89]；在对免疫性肝纤维化大鼠的研究中发现，TGP可通过抑制核因子NF-κB和TGF-β1的表达而发挥抗肝纤维化作用[90]。近来研究发现，白芍的另一化学成分白芍多糖对D-半乳糖胺/脂多糖所诱导的小鼠肝损伤具有一定的保护作用，能显著降低小鼠血清中ALT、AST水平，提高肝组织中SOD水平同时降低MDA水平，从而提高体内氧自由基清除能力而发挥保肝作用[91]。柴胡：为伞形科植物柴胡BupleurumchinensieDC.或狭叶柴胡BupleurumscorzonerifoliumWilld.的干燥根，按性状不同，有北柴胡、南柴胡之分，早在《神农本草经》便有记载。其性微寒，味苦、辛，归肝胆二经，具有解表退热、疏肝解郁、升举阳气之效。善于祛邪解表退热、疏散少阳半表半里之邪，对于外感表证发热，无论风寒、风热均可使用；常用于肝失疏泄、气机郁阻所致的胸胁、少腹胀痛等症；还可用治中气不足、气虚下陷所致的脘腹重坠作胀、脏器脱垂等；对于疟疾寒热亦常用[92]。现代研究表明，柴胡含有皂苷、黄酮、甾醇、挥发油、有机酸、香豆素、糖类、木脂素、多炔类及生物碱等多种化学成分，具有解热镇痛、镇咳、抗炎、抗溃疡、抗病原体、保肝及调节免疫功能，对心血管系统也有显著作用[93]。其中，柴胡皂苷（SS）为保肝作用的主要活性成分，主要体现在以下几个方面[94]：⑴降低细胞色素P450活性，促进肝细胞再生；⑵刺激垂体肾上腺皮质系统，增加内源性糖皮质激素的分泌；⑶抑制脱氢酶的辅酶细胞色素C还原酶活性，减少激素样副作用的反应；⑷使巨细胞活性化，促进产生抗体和干扰素；⑸促进蛋白的合成，增加肝糖原，减少过氧化脂质，从而促进肝细胞再生；⑹使NK细胞和LAK的活性增强。实验研究表明，SS能抑制肝纤维化大鼠血清ALT、AST和ALP的51 第二部分肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化免疫组化研究升高，抑制TP和ALB的降低，并能降低HA、IV-C、LN的含量，具有保护肝细胞、抗肝纤维化的作用[95]。柴胡皂苷D（SS-d）可抑制免疫性肝纤维化大鼠血清中HA、LN、PCIII指标的升高，减轻肝组织中Hyp、MDA的含量，升高SOD活性，下调肝组织中TGF-β1mRNA和蛋白的表达水平[96]；能升高血清中IL-10和NO水平，降低TNF-α水平[97]；能改善肝纤维化大鼠组织型纤溶酶原激活因子（TPA）、纤溶酶原抑制因子（PAI）纤溶活性，改善纤溶功能，发挥抗肝纤维化作用[98]。SS不仅能够保肝、抗肝纤维化，对肝癌亦有一定的防治作用。杨春燕的研究表明，SS-d可显著抑制肝癌HepG2细胞增殖，并能增加HepG2细胞自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3Ⅱ（LC3-Ⅱ）的表达，从而发挥抗癌作用[99]。此外，柴胡与其他中药配伍的复方制剂也有较好的抗肝纤维化作用。研究发现，柴胡疏肝散能显著降低肝纤维化大鼠肝组织TGF-β1、Smad3mRNA和蛋白的表达，增加Smad7的表达水平，通过影响TGF-β1/Smad信号通路而发挥抗肝纤维化作用[100]。4.4GDFMT对TX小鼠肝纤维化肝组织TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7蛋白表达的影响本实验采用免疫组化法检测肝纤维化TX小鼠肝组织中TGF-β1、TβRI、TβRII、Smad2、Smad3、Smad4和Smad7蛋白的表达水平变化，探讨在GDFMT的作用、不同浓度及不同时间干预下，对这些分子表达水平的影响。治疗2周和治疗4周后均可见如下结果。与正常组比较，模型组TGF-β1、TβRI、TβRII、Smad2、Smad3和Smad4蛋白的表达明显升高，Smad7蛋白的表达明显降低(P<0.01)。与模型组比较，各治疗组TGF-β1、TβRI、TβRII、Smad2、Smad3和Smad4蛋白表达均降低，Smad7蛋白表达则升高(P<0.05，P<0.01)。与丹参组、青霉胺组及低、中剂量组比较，高剂量组TGF-β1、TβRI、TβRII、Smad2、Smad3和Smad4蛋白表达明显降低，Smad7蛋白的表达则明显升高(P<0.01)，表明高剂量组对上述指标的干预作用优于其他各组。与青霉胺组及低剂量组比较，丹参组和中剂量组TGF-β1、TβRI、TβRII、Smad2、Smad3和Smad4蛋白表达均明显降低，Smad7蛋白的表达明显升高(P<0.05，P<0.01)，表明丹参组和中剂量组对上述指标的干预作用优于青霉胺组和低剂量组；而丹参组与中剂量组的比较差异无统计学意义52 基于Wilson病肝纤维化临床证候特征的肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化免疫组化研究(P>0.05)。与低剂量组比较，青霉胺组TGF-β1、TβRI、TβRII、Smad2、Smad3和Smad4蛋白的表达降低，Smad7蛋白的表达升高(P<0.05，P<0.01)，表明青霉胺组对上述指标的干预作用优于低剂量组。与治疗2周结果比较，各治疗组在治疗4周结束TGF-β1、TβRI、TβRII、Smad2、Smad3和Smad4蛋白表达均降低，Smad7蛋白表达则升高(P<0.05，P<0.01)，表明各治疗药物对上述指标的干预作用呈时间依赖性，随治疗时间的延长，干预作用增强。53 结论结论（1）WD肝纤维化以肝肾亏虚、痰瘀互结证为主要特征，病变脏腑顺位为肝、肾、脾、心；中医证候分布与WD肝纤维化患者年龄和病程有关，与性别无关。（2）GDFMT能有效抑制TGF-β1、TβRI、TβRII、Smad2、Smad3、Smad4蛋白的表达，促进Smad7蛋白表达，并呈显著剂量、时间依赖性，从而降低肝星状细胞（Hsc）的活化，减少细胞外基质（ECM）的分泌，发挥抗肝纤维化作用。54 基于Wilson病肝纤维化临床证候特征的肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化免疫组化研究参考文献[1]贾建平,陈生弟.神经病学(第7版)[M].北京:人民卫生出版社,2013:287.[2]徐彬,余元勋,鲍远程,等.ATP7B基因突变与肝豆状核变性发病关系的探讨[J].安徽医科大学学报,2015,50(12):1762-1766.[3]杨文明,韩辉,鲍远程,等.中医对肝豆状核变性病因病机及辨证论治的探索[J].北京中医药大学学报(中医临床版),2012,19(4):6-9.[4]张荣信,杨文明,汪美霞.肝豆状核变性患者肝纤维化的发病机制及中医治疗[J].中医药临床杂志,2012,24(3):262-264.[5]中国中西医结合学会肝病专业委员会.肝纤维化中西医结合诊疗指南[J].中国肝脏病杂志(电子版),2010,2(4):54-59.[6]杨文明,陈彪,鲍远程,等.肝豆状核变性病中医临床思考[J].中国实验方剂学杂志,2004,10(6):66-69.[7]杨文明,方芳,汪美霞,等.肝豆扶木汤治疗Wilson病肝纤维化的临床研究[J].中医药临床杂志,2014,26(11):1111-1113.[8]李睿.肝豆扶木汤对肝豆状核变性肝纤维化临床效用及其对TGF-β1/Smad信号转导通路的影响[D].安徽:安徽中医药大学,2015.[9]杨文明,洪亮,汪美霞,等.肝豆扶木汤对实验性Wilson病模型大鼠肝铜、血清铜及肝组织自由基代谢的影响[J].中医药临床杂志,2010,22(11):1010-1012.[10]杨文明,洪亮,董婷,等.肝豆扶木汤对实验性Wilson病模型大鼠肝损害的保护作用[J].中医药临床杂志,2010,22(11):1013-1016.[11]中华医学会神经病学分会帕金森病及运动障碍学组,中华医学会神经病学分会神经遗传病学组.肝豆状核变性的诊断与治疗指南[J].中华神经科杂志,2008,41(8):566-569.[12]李祥,杨文明,汪瀚,等.肝风论[J].中医药临床杂志,2013,25(3):198-200.[13]杨任民.肝豆状核变性的中西医结合治疗[J].中国中西医结合杂志,2007,27(9):773-775.[14]汪瀚,杨文明,鲍远程.从铜毒论治肝豆状核变性初探[J].安徽中医学院学55 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基于Wilson病肝纤维化临床证候特征的肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化免疫组化研究综述肝纤维化中医药治疗进展肝纤维化是一种组织病理学概念，在国际疾病分类中可作为一种独立的病名，主要是指肝组织内细胞外基质（ECM）成分过度增生、异常沉积，致使肝脏结构或功能异常的病理变化。结构上主要表现为肝窦毛细血管化、肝小叶内及汇管区纤维化；功能上可表现为肝功能减退及门脉高压等。多种损伤因素（肝炎病毒、酒精、遗传和代谢、药物与毒物、胆汁淤积、血吸虫、自身免疫性肝病等）长期刺激肝脏可使肝窦内肝星状细胞（Hsc）活化，胶原等ECM成分代谢失衡，生成多于降解，从而使肝脏ECM沉积、组织结构重构[1]。因其具有病程长、病情重、易发展为肝硬化的特点，早期治疗尤为重要。大量研究证实，肝纤维化同一定程度的肝硬化经早期积极治疗，可以抑制肝纤维化进一步发展甚至逆转，改善患者的肝功能，改善患者的生活质量，延长生存期。中医学没有肝纤维化的记载，根据其临床表现，可归于“黄疸”、“胁痛”、“积聚”、“肝积”等范畴。中医学在长期的实践中对肝纤维化有独特的认识，不同的医家对其病机的认识有所不同，目前主要有以下5种论说，即瘀血论、痰浊论、毒邪论、络病论和正虚论[2]。但实际临床工作中，肝纤维化是一个动态变化的复杂过程，其病机往往是复合病机，并非单一的一种。薛博瑜等[3]认为湿热疫毒入侵为肝纤维化的主要病因，并与正气不足有关，其病机关键为热毒瘀结、肝脾损伤。齐洪军等[4]认为，痰瘀互结，阻滞肝络是肝纤维化病机的关键，亦是共同的病理基础。鲁玉辉等[5]提出，湿热为肝纤维化发展的始动因素，久则化瘀入络。中国中西医结合肝脏病学会[1]亦对肝纤维化的病机提出指导意见，认为其基本证候病机为正虚血瘀，以气阴虚损、瘀血阻络常见。各医家虽对肝纤维化的病因病机认识有不同侧重，但一致认为存在湿热毒邪、正虚瘀结的病机。目前西医对于肝纤维化的治疗主要从以下几个方面着手[6]：治疗原发病，去除病因；保护肝细胞；抑制肝脏炎症；抑制Hsc活化；增加ECM降解；诱导Hsc凋亡；基因治疗。大量研究显示，中医药治疗肝纤维化可取得较好的临床疗效，且安全可靠，具有多途径、多系统作用的特点。本文就中医药抗肝纤维化的研究63 综述概况作一综述。1.辨证论治辨证，是中医诊断疾病的重要内容，是中医防治疾病一贯遵从的基本法则。中国中西医结合肝脏病学会[1]认为，在肝纤维化病变发展的不同阶段，可表现为肝胆湿热、肝郁脾虚、肝肾阴虚等不同的证候类型。1.1肝胆湿热证：常有胁肋胀痛、胸脘痞闷，口苦口臭，身目黄染，纳呆乏力，尿赤便结，舌质红，苔黄腻，脉弦滑数等表现。治以清热化湿为法。常用药物有：茵陈、栀子、大黄、黄芩、泽泻和车前子等，可予茵陈蒿汤加味。杨壮智等[7]应用茵陈蒿汤加味治疗慢性乙型肝炎肝纤维化辨证属湿热型患者，发现其能够降低血清HA、LN、PCIII、IV-C含量，发挥抗肝纤维化作用。张斌等[8]选用虎杖、郁金、苦参、茯苓等药组方而成虎杖清肝汤，治疗慢性乙型肝炎辨证属肝胆湿热兼血瘀证患者，发现其能明显减轻患者胁痛、腹胀、纳差等临床症状，改善肝功能，降低血清HA、LN、PCIII、IV-C含量，发挥抗肝纤维化作用，并且能够降低纤溶酶原激活物及其抑制物含量。1.2肝郁脾虚证：常有胁肋胀痛，精神抑郁，胸闷善太息，脘腹痞闷，面色萎黄，神疲乏力，大便不调，舌质淡胖，苔白，脉沉弦等表现。治以疏肝健脾为法。常用药物有：柴胡、白术、赤白芍、当归、薄荷、茯苓和川芎等，可予逍遥散加减。张智等[9]选用柴胡、白芍、半夏、茯苓、白术、陈皮、党参和甘草组方而成柴芍六君子方，用以治疗肝纤维化肝郁脾虚证患者，发现其能有效改善临床症状，改善肝纤四项及肝硬度水平。代琳等[10]选用当归、芍药、郁金、枸杞、沙参、山药、川楝子、丹参等20味中草药组方而成保肝复功丸，用以治疗肝郁脾虚型肝炎肝纤维化患者，发现该药能明显改善患者的肝功能及肝纤维化血清学指标。1.3肝肾阴虚证：常有胁肋隐痛，腰膝酸软，五心烦热，头晕目眩，口燥咽干，两目干涩，失眠多梦，舌红少津，脉弦细数等表现。治以滋补肝肾为法。常用药物有：沙参、麦冬、生地、枸杞、山药、当归、丹皮、泽泻、茯苓和山茱萸等，可选用一贯煎加减。刘文兰等[11]观察一贯煎对肝纤维化大鼠阴虚证表征的影响，发现其能改善肝功能，减轻炎症，具有抗肝纤维化的作用，不仅能够改善肝纤维化大鼠的病理，还能够改善阴虚证的症状。64 基于Wilson病肝纤维化临床证候特征的肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化免疫组化研究2.经验方2.1肝豆扶木汤（GDFMT）：是安徽中医药大学第一附属医院杨文明教授针对肝豆状核变性肝损害、肝纤维化的肝肾亏虚、血瘀湿阻这一临床常见病机组方而成。全方由何首乌、枸杞、土茯苓、白芍、三七、郁金、柴胡等中药组成，具有补益肝肾、豁痰化瘀之效。前期临床研究表明，GDFMT能够明显改善WD肝纤维化患者UWDRS量表肝脏功能积分，降低肝型WD肝纤维化患者中医证候积分，能促进患者尿铜排泄，降低血清TIMP-1、TGF-β1和TNF-α的含量，提高血清MMP2、MMP9、ALT和AST的水平，发挥抗肝纤维化作用[12,13]。前期实验研究表明，GDFMT能降低WD模型铜负荷大鼠肝铜及血清铜含量，具有排铜功效，并能降低大鼠肝组织中MDA含量，提高SOD活性，纠正氧化、抗氧化失衡，以预防治疗脂质过氧化[14]；能降低其血清中ALT、AST活力及AST/ALT比值，提高血清TP、ALB水平，减轻WD模型大鼠肝细胞坏死、纤维增生及脂肪变性的程度，发挥显著的保肝作用[15]；通过HE和Masson染色观察发现，其还能有效地改善肝纤维化TX小鼠的肝组织病理[13]。2.2复方861合剂：由丹参、黄芪、香附、陈皮、鸡血藤等10味中药组成。尹珊珊等[16]的研究表明，复方861合剂能够降低慢性乙型肝炎肝纤维化、早期肝硬化患者血清ALT、AST、MMP9和TIMP1，治疗后肝穿病理组织学检查显示其胶原相对含量较治疗前下降，从而逆转慢性乙型肝炎肝纤维化和早期肝硬化。3.中成药3.1扶正化瘀胶囊（片）：由丹参、虫草菌粉、桃仁、绞股蓝、松花粉、五味子组成，具有活血化瘀、清热解毒和扶正补气的功效。目前研究表明，扶正化瘀胶囊（片）具有明确的治疗肝纤维化、肝硬化的疗效。邓鑫等进行的一项多中心、临床、随机、对照试验表明，扶正化瘀片可改善肝功能、肝纤维化及门脉高压状态，提高患者的生活质量和2年生存率[17]。扶正化瘀胶囊（片）与其他药物联合使用可提高临床疗效。将扶正化瘀胶囊与抗乙肝病毒的核苷类药物如拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦、替比夫定等同时应用于乙肝病毒所致慢性肝炎肝纤维化和肝硬化患者，与单用扶正化瘀胶囊、单用抗病毒药物对照，结果显示联合用药在改善患者的症状体征、肝功能、肝纤四项及超声检查变化方面均优于对照组；其阻65 综述滞并逆转肝纤维化的作用机制之一在于调整细胞免疫，间接抑制Hsc的活化、增殖，促进其凋亡[18]。3.2复方鳖甲软肝片：由鳖甲、三七、冬虫夏草、黄芪、党参、赤芍、紫河车、连翘、当归、莪术及板蓝根这11味中药组成，具有软坚散结、化瘀解毒、益气养血的功效。实验研究表明，复方鳖甲软肝片减少CCl4诱导肝纤维化模型大鼠肝组织内TIMP-1和TIMP-2表达量，增加MMP-2、MMP-13酶降解活性，上调MMPs和MT-MMPs酶蛋白及mRNA表达，减少TGF-β1及其mRNA表达，较少α-SMA阳性Hsc数量，从而通过多靶点发挥抗肝纤维化功效[19]。在临床研究方面，周光德等[20]将65例慢性乙型肝炎患者经复方鳖甲软肝片治疗前后进行肝穿检查，采用Ishak评分系统进行组织学疗效评价，应用原位末端标记技术POD法和α-SMA单抗免疫组化法双标记显示肝组织内活化Hsc凋亡状况，结果显示，治疗后肝组织炎症活动度和肝纤维化程度均较治疗前明显改善，肝组织内活化Hsc数量明显减少，凋亡的活化Hsc数量显著增加，从而通过抑制Hsc活化、促进活化Hsc凋亡发挥抗肝纤维化作用。4.单味中药4.1丹参：近来，丹参及其复方制剂、丹参有效成分在慢性肝病特别是肝纤维化的治疗方面得到广泛应用。其抗肝纤维化的作用主要体现在以下方面[21]：⑴清除氧自由基，抗脂质过氧化，保护肝细胞；⑵抑制成纤维细胞的增殖及胶原的合成；⑶抑制信号转导通路。刘兆凤等[22]研究表明，丹参滴丸能明显抑制肝纤维化大鼠血清中ALT、AST的活性，降低IV-C含量，降低肝组织中MDA的量，提高SOD的活性，通过抗脂质过氧化、抑制胶原增加及降低α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达，发挥抗肝纤维化作用。王春生等[23]研究发现，丹参单体IH764-3可能通过下调TIMP-2、上调膜型基质金属蛋白酶（MT1-MMP）和MMP-2表达，调控Hsc胶原代谢，发挥抗肝纤维化作用。4.2何首乌：现代研究表明，何首乌中含有的二苯乙烯苷是保肝的主要有效成分[24]，而所含的大黄素能改善四氯化碳诱导的肝纤维化大鼠肝功能，并降低HA、LN水平，从而发挥保肝、抗肝纤维化作用，其机制可能与上调Smad7、下调Smad3mRNA和蛋白的表达、下调α-SMA蛋白表达，进而抑制肝星状细胞活化有关[25-27]。大黄66 基于Wilson病肝纤维化临床证候特征的肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化免疫组化研究酸亦具有保肝和抗肝纤维化作用，可能与抗炎、抗氧化、抑制TGFβ1的活性、抑制肝星状细胞活化有关[28]。万晓强等[29]的研究发现，大黄酸能有效减轻猪血清诱导的肝纤维化大鼠的肝损伤及纤维化程度，这可能与抑制TGFβ1和肝内结缔组织生长因子的表达有关。4.3枸杞：宁夏枸杞对肝损伤有很好的保护修复作用，枸杞多糖为其主要活性成分[30]。实验研究表明，枸杞粗多糖多次灌胃给药，能明显抑制四氯化碳所致肝损伤小鼠ALT的升高，增加肝糖原的含量，并能明显降低肝脏中丙二醛的含量，对正常小鼠亦具有明显的利胆和促进部分肝切除后肝脏再生作用[31]。最近的研究表明，枸杞中的甜菜碱成分能够抑制复合致病因素诱导的大鼠肝纤维化，其作用可能与降低大鼠体内高同型半胱氨酸、调节炎性细胞因子和氧化应激有关[32]。4.4三七：现代研究表明，三七含有三七总皂甙(PNS)[33]，是保肝、抗肝纤维化、防治肝癌的主要活性成分。实验研究发现，PNS能明显改善四氯化碳致肝纤维化大鼠的肝功能，降低血清HA、PCIII含量，降低肝组织羟脯氨酸，从而减轻贮脂细胞增生及胶原沉积；可显著上调基质金属蛋白酶-13（MMP-13）、抑制基质金属蛋白酶抑制因子-1（TIMP-1）的表达，促进胶原降解；可通过上调Bcl-2的表达、下调Bax的表达，抑制肝细胞的凋亡；还能显著抑制肿瘤坏死因子-α(TNFα)、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)、核因子NF-κB、转化生长因子-β(TGF-β)及Smad3的表达，升高白细胞介素-10(IL-10)的水平，从而下调促炎因子、上调抑炎因子的产生，发挥抗肝纤维化作用[34-38]。4.5土茯苓：现代研究表明，土茯苓具有抗动脉粥样硬化、抗血栓、抗心肌缺血、抗氧化、保肝、抗炎、镇痛、免疫抑制、利尿、抗胃溃疡、抗肿瘤和抗菌等作用[39,40]，辛淮生等[41]的研究发现，土茯苓水煎剂对大鼠的实验性肝损伤具有保护作用，它能明显拮抗硫代乙酰胺中毒大鼠中毒性肝细胞坏死后5种血清肝酶谱的升高。邓勤智等[42]的研究表明，土茯苓组方可提高乙型肝炎病毒慢加急性肝衰竭患者的好转率，改善临床症状、肝功能及6个月内的生存率。4.6郁金：现代研究表明，郁金具有保护肝细胞，促进肝细胞再生，抗癌，抗菌，抗氧化、抗病毒等作用[43]。在抗肝纤维化作用方面，实验研究表明，广西桂郁金能降低肝纤维化大鼠肝组织中羟脯氨酸(Hyp)、MDA的含量，增加SOD、谷胱甘67 综述肽过氧化物酶(GSH-Px)的含量，具备良好的抗脂质过氧化作用，能清除自由基、抗肝损伤[44]；能降低肝纤维化大鼠血清ALT、AST、GLB水平，提高ALB水平，降低HA、LN、PCIII含量而发挥抗肝纤维化作用[45]；能抑制HSC-LX2细胞分泌Ⅰ型、Ⅲ型胶原，并增加其分泌MMP-1和MMP-13的能力[46]，从而干预肝纤维化的病程。4.7白芍：白芍含有的白芍总苷（TGP）是保肝、抗肝纤维化的主要有效成分[47]。研究表明，TGP对四氯化碳致大鼠肝纤维化有较好的治疗作用，其机制与降低肝星状细胞（HSC）分泌HA和PCIII，促进HSC凋亡有关[48]；在对免疫性肝纤维化大鼠的研究中发现，TGP可通过抑制核因子NF-κB和TGF-β1的表达而发挥抗肝纤维化作用[49]。近来研究发现，白芍的另一化学成分白芍多糖对D-半乳糖胺/脂多糖所诱导的小鼠肝损伤具有一定的保护作用，能显著降低小鼠血清中ALT、AST水平，提高肝组织中SOD水平同时降低MDA水平，从而提高体内氧自由基清除能力而发挥保肝作用[50]。4.8柴胡：柴胡皂苷（SS）为保肝作用的主要活性成分[51]。实验研究表明，SS能抑制肝纤维化大鼠血清ALT、AST和ALP的升高，抑制TP和ALB的降低，并能降低HA、IV-C、LN的含量，具有保护肝细胞、抗肝纤维化的作用[52]。柴胡皂苷D（SS-d）可抑制免疫性肝纤维化大鼠血清中HA、LN、PCIII指标的升高，减轻肝组织中Hyp、MDA的含量，升高SOD活性，下调肝组织中TGF-β1mRNA和蛋白的表达水平[53]；能升高血清中IL-10和NO水平，降低TNF-α水平[54]；能改善肝纤维化大鼠组织型纤溶酶原激活因子（TPA）、纤溶酶原抑制因子（PAI）纤溶活性，改善纤溶功能，发挥抗肝纤维化作用[55]。SS不仅能够保肝、抗肝纤维化，对肝癌亦有一定的防治作用。杨春燕的研究表明，SS-d可显著抑制肝癌HepG2细胞增殖，并能增加HepG2细胞自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3Ⅱ（LC3-Ⅱ）的表达，从而发挥抗癌作用[56]。4.9五味子：五味子具有保肝、抗肝纤维化的作用，枸杞多糖为其主要活性成分[57]。许珂玉等[58]的研究发现，五味子粗多糖能够降低肝纤维化大鼠血清ALT和AST含量，降低肝中MDA含量，升高SOD活性，从而发挥减轻肝损害、减轻脂质过氧化和抗肝纤维化作用。李宜轩等[59]的研究表明，北五味子提取物能够改善肝功68 基于Wilson病肝纤维化临床证候特征的肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化免疫组化研究能，抑制肝胶原纤维的生成，升高ALB水平，减轻肝细胞脂质过氧化损伤，从而起到防治肝纤维化的作用。4.10虎杖：大黄素和白藜芦醇苷为虎杖抗肝纤维化的主要活性成分[60]。王晓丽等[61]的研究表明，大黄素能够通过上调Smad7、下调α-SMA蛋白的表达，抑制Hsc活化，从而逆转大鼠肝纤维化。董妙先等[62,63]的研究发现，大黄素可能通过下调Smad3mRNA和蛋白的表达，下调纤维化肝组织I型前胶原mRNA表达，有效逆转大鼠肝纤维化。5.针灸针灸具有疏通经络、运行气血、补虚泻实及调整阴阳的作用。近来研究表明，针灸能够起到保护肝脏，改善肝纤维化的作用。闵友江等[64]电针肝纤维化大鼠的肝俞和足三里穴位，发现其能够下调大鼠I型和III型胶原mRNA表达，发挥抗肝纤维化作用。田年秀等的研究表明，刺络泻血法以及针刺肝俞、足三里的合俞配穴法能通过下调大鼠细胞外基质HA和LN水平，减少大鼠肝纤维组织增生，阻止肝纤维化发展[65,66]。天灸也有一定的防治肝纤维化的作用[67]。6.结语中医药抗肝纤维化疗效显著，得到了国际社会越来越多的肯定，大量的研究发现，中医药抗肝纤维化的作用机制涉及多个环节和靶点，相比较作用靶点单一的西药显现了独特的优势。但目前对于中药抗肝纤维化的临床研究尚缺乏多中心、大样本的研究验证，遵循循证医学原理的、设计严谨的临床试验将有助于发挥中医药的巨大潜力。此外，综合多学科技术深入研究单味中药及中药复方抗肝纤维化的有效成分、药理作用，明确其确切的作用靶点及作用机制是今后研究的重要任务之一。参考文献[1]中国中西医结合学会肝病专业委员会.肝纤维化中西医结合诊疗指南[J].中国肝脏病杂志(电子版),2010,2(4):54-59.[2]马继征,张云,陈兰羽,等.肝纤维化的中医病机认识及治则治法研究[J].中西医结合肝病杂志,2014,24(6):381-382.[3]薛博瑜,顾学兰.肝纤维化的病机认识和辨证论治[J].南京中医药大学学报(自然69 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致谢致谢光阴荏苒，白驹过隙，硕士研究生的学习生涯即将结束，三年的学习生活使我受益匪浅。硕士毕业论文几经修改，现在终于完稿。首先，我要深深感谢我的导师杨文明教授，他为人谦和，平易近人，本研究及学位论文是在杨文明老师的亲切关怀和悉心指导下完成的。从论文的选题到课题的最终完成，导师都始终给予我悉心的指导和不懈的支持，我为能追随在他的身后,由他引领我在医学的殿堂里寻求科学和真理而感到幸运。蒙教三年，导师忘我的工作作风、严谨的治学态度、渊博的学术知识、实事求是的科研态度以及精益求精的追求精神将影响和激励我的一生，他精湛的医术、高尚的医德医风，永远是我学习的榜样，他对我的关心和教诲我更将永远铭记！借此机会，我谨向尊敬的杨老师致以最深的敬意和最诚挚的谢意！其次，我要衷心感谢鲍远程教授、谢道俊教授、陈怀珍教授、张波教授、汪瀚主任给我的无私帮助和悉心指导！感谢汪美霞、王晓旸、董婷、韩辉等神经内科的所有老师和护理部老师在我临床实习阶段给予的帮助！感谢中国科学技术大学理化科学实验中心余华明主任、安徽省中医院病理科窦红漫主任及吴赛青老师对我实验过程的帮助和指导！感谢何望生、李祥、张荣信、王玮、黄鹏、魏涛华、李睿、方淑珍、董薇、胡雅在病例收集及实验研究中给予的帮助，感谢江海林、刘丹青、韩小敬等同门及周蕾、李青松、周涛的友情相助！感谢父母和家人多年来一如既往的支持、鼓励和关心！最后，衷心感谢所有关心、支持和帮助过我的老师、同学和朋友，永远铭记在心！谢文婷2016年5月于安徽中医药大学76
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