fk506治疗大鼠早期膜性肾病的实验研究

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FK506治疗大鼠早期膜性肾病的实验研究作者：贾冶王晶顾华吴曼郭桥艳徐锋刘庆鑫许钟镐苗里宁【摘要】目的观察FK506治疗大鼠膜性肾病的疗效。方法复制Wistar大鼠膜性肾病模型。实验分为3组：正常组(N组)，模型组(M组)，FK506治疗组(FK506组)，每组12只。用阳离子化牛血清白蛋白制作大鼠膜性肾病模型,于正式免疫开始后2、4、6、8w检测大鼠24h尿蛋白定量;最后心脏取血，测定血清肌酐、尿素氮、白蛋白水平。处死大鼠后取肾观察肾组织病理改变;应用免疫组织化学方法检测肾组织中TGFβ1与NFκB的表达，应用Western印迹法测定大鼠肾组织中TGFβ1蛋白表达的变化。结果M组与N组相比出现大量蛋白尿，血清白蛋白水平降低。免疫组化检测结果示M组TGFβ1和NFκB的表达均高于N组，而FK506组的水平低于M组。Western印迹法显示M组及FK506组TGFβ1高于N组，FK506组的水平低于M组。结论FK506能降低膜性肾病大鼠尿蛋白，提高血清白蛋白，可抑制肾组织TGFβ1与NFκB的表达，用其防治大鼠早期膜性肾病有较好的疗效。【关键词】FK506;TGFβ1;膜性肾病11 　　【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheeffectofFK506onthemembranousnephropathyinrat.MethodsMembranousnephropathyratswereinducedbyCBSA.Wistarratsweredividedintonormalcontrol(N),membranousnephropathy(M),andFK506treatment(FK506)groups.Urinaryproteinexcretionwasmeasuredat2,4,6,8wfromthebeginningofimmunization.Theratbloodwasobtainedviacardiacpuncture,andthekidneyswereremoved.ThebloodsamplesweresavedformeasuringthelevelsofserumBUN,ScrandALB.Kidneyspecimenswereroutinelyprocessedforlightmicroscopy.ImmunohistochemistrymethodwasperformedtoobservetheexpressionsofTGFβ1andNFκB.TGFβproteinexpressionwasmeasuredbyWesternblot.ResultsUrinaryproteinexcretioningroupMwassignificantlyhigherthanthatingroupN.ThelevelofserumALBingroupMwaslowerthanthatingroupN.UpregulationofTGFβ1andNFκBexpressionwereobservedinimmunohistochemicalfindings.ConclusionswiththatinMgroup,urinaryproteinexcretionwassignificantlydecreasedandthelevelofserumALBwassignificantlyincreasedinFK506group.ImmunohistochemistryshowedthattheexpressionsofTGFβ1andNFκBweresignificantlylowerinFK506groupthanthoseingroupM.TheTGFβ1proteinexpressionwassignificantlylowerinFK50611 groupthanthatinMgroupbyWesternblot.ConclusionsFK506canreduceurinaryproteinexcretion,increasethelevelofALB,improvekidneypathologicalchanges,inhibitTGFβ1overexpressionandNFκBactivationinrenaltissueofmembranousnephropathyrats,andcanbeusedfortreatmentofearlymembranousnephropathy.　　【Keywords】FK506;TGFβ1;Membranousnephropathy　膜性肾病(membranousnephropathy，MN)是中老年人常见的肾脏疾病，临床以无症状蛋白尿或肾病综合征为主要表现，病理以肾小球基底膜(GBM)上皮细胞下弥漫的免疫复合物沉着伴基底膜增厚为特点。MN的病因及机制尚不清楚，目前治疗主要应用激素加免疫抑制剂。FK506做为一种新型的免疫抑制剂，目前主要用于器官移植，并且在治疗特异性皮炎、系统性红斑狼疮、自身免疫性眼病等疾病中发挥作用，而在治疗肾小球肾炎，尤其是MN方面的研究尚少。本实验观察FK506对MN模型大鼠24h尿蛋白定量、肾功能、肾组织TGFβ1、NFκB的影响，旨在探讨FK506对MN的治疗作用及其机制。　　1材料与方法　　1.1主要试剂和材料11 FK506(爱尔兰藤泽药品有限公司)，牛血清白蛋白(上海缘聚生物科技有限公司)，碳化二亚胺(沈阳国药集团)，兔抗大鼠TGFβ1多克隆抗体(北京莱博生物实验材料研究所)，兔抗大鼠NFκBp65多克隆抗体(NFκB)(武汉博士德生物工程有限公司)，考马斯亮蓝法测尿蛋白试剂盒(南京建成生物工程有限公司)，免疫组织化学试剂盒(美国DakoCorporation)。　　1.2方法健康Wistar大鼠，雄性，重200～230g(吉林大学基础医学院动物实验中心)，参照Border法〔1〕建立大鼠MN模型，根据实验用药，将动物随机分为3组，每组12只。正常对照组(N组);模型组(M组)，不予任何药物治疗;FK506治疗组(FK506组)，由开始正式免疫第3周起每天给予FK506(2mg/kg)灌胃，共4w。M组和N组每日同等剂量溶媒灌胃。实验中于模型大鼠正式免疫开始后2、4、6、8w将大鼠放入金属代谢笼中，准确收集24h尿液。留取最后一次24h尿液。各组大鼠经乙醚麻醉，先行心脏取血，收集血样本，静置后4℃离心15min，3000r/min，取血清保存在-70℃冰箱待测血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、白蛋白(ALB)水平。最后剖开腹腔，游离肾脏，取多块肾组织，一部分在-70℃冰箱保存，一部分置于10%中性甲醛溶液中固定。　　1.3免疫组织化学法采用免疫组化染色法，检测肾组织中TGFβ1和NFκB的表达情况。石蜡切片常规脱蜡水化;1%H2O2作用15min，PBS洗;0.05%胰蛋白酶液37℃作用3011 min，PBS洗;10%正常山羊血清孵育15min抑制非特异性结合;滴加TGFβ1和NFκB一抗，4℃过夜，PBS洗;滴加二抗(生物素化兔抗鼠IgG)，37℃孵育30min，PBS洗;滴加复合物(链霉素抗生物素蛋白过氧化物酶溶液)，37℃孵育30min;DAB显色，水洗后用苏木素复染，透明封片。　　1.4Western印迹法用超声碎裂法提取蛋白后，根据蛋白浓度取等量蛋白，在12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳中电泳后转移至尼龙膜上。在丽春红染液中染色观察蛋白转移情况并标出蛋白质相对质量分子质量标准。然后用5%脱脂牛奶进行封闭，之后加入抗TGFβ1进行杂交，4℃过夜。洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的第二抗体进行杂交，室温孵育1h。再次洗膜后用ECL试剂显像并曝光成像。利用图像分析系统扫描确定X片上杂交条带的相对吸光度值。　　1.5统计学处理数据以x±s表示，应用SPSS11.5软件包进行统计分析，两组以上比较采用ANOVA检验。　　2结果　　2.1大鼠MN模型的建立实验中发现大鼠自正式免疫后2w出现蛋白尿,尿蛋白试纸测定结果为(～),24h蛋白定量明显高于N组(P<0.05)。继续给予CBAS后，第4周末时定性检查为(～)，2411 h尿蛋白定量明显增加，与N组比较提示为大量蛋白尿(P<0.05)。处死大鼠后留取血清测定　　ALB，与N组比较提示ALB水平降低(P<0.05)，Scr、BUN水平较正常无明显差异。肾组织病理检查示肾小球毛细血管壁明显增厚、僵硬，偶可见钉突形成，肾小管上皮细胞弥漫性颗粒样及局灶空泡变性，小管内可见蛋白管型，PAM+MASSON染色可见肾小球基底膜增厚、僵硬，偶可见钉突形成，上皮下疑似嗜复红物存在。电镜观察示肾小球基底膜增厚，足突融合变平或消失，上皮下可见团块状电子致密物沉积，足细胞肿胀、形状不规则，胞质空化、轻度绒毛化，内质网扩张，溶酶体明显增多。　　2.2大鼠24h尿蛋白、Scr、BUN、ALB变化与N组相比，M组自正式免疫后2、4、6、8w的尿蛋白定量均明显升高(P<0.01)。FK506组于给药后2、4w的24h尿蛋白量均明显高于N组，但明显低于M组(2w时P<0.05，4、6、8w时P<0.01)(见表1)。与N组比较，M组的血清ALB水平降低(P<0.01);FK506组ALB水平较M组明显升高(P<0.01)(见表1)。各组间血清肌酐、尿素氮差异均无显著意义(见表1)。　　2.3免疫组化染色结果。　　2.3.1TGFβ1免疫组化染色结果N组大鼠肾脏中TGFβ11 1阳性染色主要出现于皮髓交界的肾小管上皮细胞胞浆内，肾小球内几乎无表达;而M组大鼠肾小球系膜细胞、上皮细胞、内皮细胞及周围肾小管上皮细胞内均有表达;FK506组肾脏中TGFβ1阳性染色强度和范围均较M组明显减轻(见图1A)。　　2.3.2NFκB免疫组化染色结果N组大鼠肾组织的肾小球囊侧壁上皮细胞、系膜细胞和肾小管上皮细胞内可见少量阳性染色，且以胞质内表达为主，表明NFκB表达及活化较弱。M组及FK506组大鼠肾组织中肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞NFκB的表达较N组增强，且细胞核内表达较强。而FK506组的阳性染色强度及范围较M组明显减轻，细胞核内表达较模型组明显减少(见图1B)。　　2.4Western印迹法结果M组及FK506组肾组织TGFβ1表达高于N组，但FK506组低于M组(见图2)。图1各组间TGFβ1(A)、NFκB(B)免疫组化染色表达的比较表1各组大鼠24h尿蛋白定量及生化指标的变化　　3讨论　　MN是一种以电子致密物在肾小球毛细血管壁上皮下沉积为特征的原位免疫复合物肾炎。应用CBAS免疫大鼠可制作大鼠MN模型，方法简便、高效，且其发病机制、病变稳定而典型，病理变化较为一致，病程经过类似人类MN。11 　　TGFβ1是具有多种生物学功能的多肽类生长因子，参与组织发育、增生、血管形成、炎症、凋亡等多种生物学过程的调节。在肾脏内，TGFβ1主要来源于肾小球系膜细胞、上皮细胞、内皮细胞、肾小管上皮细胞及浸润的单核细胞。TGFβ1是一种重要的促纤维化因子，在肾小球硬化和肾间质纤维化中扮演着极其重要的角色，可通过促进细胞外基质(ECM)的合成或ECM降解来调节ECM的形成，而ECM在肾小球的异常沉积是引起肾小球硬化的主要原因之一。已证明TGFβ1与肾小球疾病的进展及肾小球纤维化的发生有着密切关系。关于TGFβ1在上皮细胞病变为主的肾小球疾病如MN中的表达情况，国内外文献报道极少。研究提示,TGFβ1与MN的发生及发展密切相关〔2～4〕。本实验应用免疫组化法及Western印迹法检测各组肾组织中TGFβ1的表达，结果发现模型组大鼠肾组织中TGFβ1的表达均较正常组高，且有显著差异，从而证明TGFβ1在CBAS诱发的MN模型大鼠中也起重要作用。　　FK506是一种强效的新型免疫抑制剂。大量动物实验与临床应用研究发现，它具有与CsA相似而更广泛的免疫抑制作用，效力比CsA高10～100倍，而毒副作用比CsA更少〔5〕。自FK506进入临床后，主要用于器官移植与自身免疫性疾病免疫抑制治疗。FK506一方面抑制IL2、IL2R、INFγ、TNFα、GM11 CSF等多种细胞因子的基因转录和表达，影响T细胞的早期激活，还可抑制免疫反应早期淋巴细胞聚集，并阻止己聚集的淋巴细胞对其他炎症细胞的吸收。这种双重抑制作用使FK506不仅可用于防止免疫反应的发生，还可用于治疗已发生的免疫反应及自身免疫性疾病。另一方面，FK506可通过抑制T细胞衍生生长因子而影响B细胞生长和抗体形成，最终引起免疫抑制达到治疗肾小球疾病的作用〔6〕。本实验显示FK506能明显减轻MN大鼠的病理改变状，与M组相比24h尿蛋白量明显降低、血清ALB升高、肾小球毛细血管壁基底膜增厚程度减轻、足突改变轻、上皮下电子致密物沉积减少、肾小管空泡样变性明显减轻，表明FK506可有效治疗MN。　　据文献报道，FK506在体外可抑制T淋巴细胞转录因子NFAT和NFκB的活性，从而抑制主要的细胞因子IL2、6、8、TGFβ1的表达，这是FK506免疫抑制的基础。本实验中经CBAS诱导形成大鼠MN模型，应用免疫组化方法观察到肾组织中NFκB和TGFβ1表达明显增加，结合既往研究表明NFκB和TGFβ1在MN的发病中起到重要作用〔7〕。经FK506治疗后，MN大鼠肾组织中NFκB和TGFβ1的表达减少，与M组相比，NFκB在胞核内的表达明显减轻，表明FK506不仅可抑制TGFβ1的表达，而且可抑制NFκB活化。Western印迹法发现M组TGFβ1高于正常对照组，FK506组的水平低于M组。　　总之，FK506能降低膜性肾病大鼠尿蛋白，提高血清白蛋白，抑制肾组织TGFβ1与NFκB的表达。TGFβ1与NFκ11 B可能与MN的发生和发展有关，FK506可降低MN肾组织中TGFβ1与NFκB的表达，发挥对MN的治疗作用。【参考文献】　　1BorderWA,WardHJ,KamilES,etal.Inductionofmembranousnephropathyinrabbitsbyadministrationofanexogenouscationicantigen〔J〕.JClinInvest，1982;69:45161.　　2YangCW,HsuchS,WuMS,etal.Glomerulartransforminggrowthfactorβ1mRNAasamarkerofglomerulosclerosisapplicationinrenalbiopsies〔J〕.Nephron,1997;77:2907.　　3HonkanenE,TeppoAM,TornrothT,etal.Urinarytransforminggrowthfactorβ1inmembranousglomerulonephritis〔J〕.NephrolDialTransplant，1997;12:25628.　　4王照明，张东生，张建民.TGFβ1mRNA在主动型Heymann肾炎中的表达〔J〕.南京铁道医学院学报,2000;19(1)：146.　　5StarglTE,FungJ,JordanM,etal.Kidney11 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