三叶青黄酮诱导smmc-7721肝癌细胞凋亡的实验研究

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1、三叶青黄酮诱导SMMC-7721肝癌细胞凋亡的实验研究作者：张立明，樊瑞军，杨凤琴【摘要】目的观察三叶青黄酮对SMMC-7721肝癌细胞诱导凋亡的作用。方法通过四氮噻唑蓝(MTT)比色法检测三叶青黄酮对细胞的抑制增殖作用;光学显微镜、荧光显微镜下形态学观察;DNA琼脂糖凝胶电泳及流式细胞仪(FCM)研究分析三叶青黄酮对肝癌细胞的诱导凋亡作用。结果三叶青黄酮能显著的抑制SMMC-7721肝癌细胞的生长，并具有浓度依赖性。光学显微镜、荧光显微镜下观察,发现细胞凋亡现象;DNA琼脂糖凝胶电泳可见DNA梯形条带;流式细胞仪(FCM)检测分析出现凋亡亚二倍体峰。结论三叶青黄酮对肝癌细胞具

2、有诱导凋亡作用,有抗肝癌的药用价值。【关键词】三叶青黄酮;肝癌细胞;凋亡　三叶青具有清热解毒、祛风化痰、活血止痛等功效[1]，用于治疗高热惊厥、肺炎、哮喘、肝炎、风湿、月经不调及恶性肿瘤，具有很好的疗效。大量的研究表明该中药具有免疫调节作用,其不仅直接作用于细胞免疫，而且通过整体作用来控制细胞免疫与细胞因子的活动。近几年，三叶青黄酮抗肿瘤作用日益受到重视。为进一步探讨三叶青抗肿瘤作用的机制，更好地开发利用三叶青，7本实验通过(MTT)比色法、光学显微镜下形态学观察、荧光显微镜观察、DNA琼脂糖凝胶电泳、流式细胞仪(FCM)测定法研究三叶青黄酮对SMMC-7721肝癌细胞诱导凋亡

3、进行研究。　　1仪器与材料　　1.1仪器酶联免疫检测仪，国营华东电子管厂研制，型号，DG-3022;流式细胞仪(FCM)，美国B&D公司产品，型号，FACS.calibur;电泳仪，北京六一仪器厂产品，型号DYY-Ⅲ1;紫外透射分析仪，上海长兴机器厂产品，型号:2F-3。　　1.2药物与试剂三叶青，宁夏明德饮片厂提供，宁夏药品检验所鉴定。青霉素，宁夏启元药业生产，规格，160万单位，批号080912;链霉素，安徽淮南国瑞药业产品，规格，0.75g，批号20090308;RPMI1640，美国Sigma公司产品;四氮噻唑蓝(MTT)，美国Sigma公司产品。　　1.3细胞

4、株及培养肝癌细胞株SMMC-7721由第四军医大学口腔医学院引进。接种于100L玻璃培养瓶中，在含10%小牛血清、青霉素100mg·L-1、链霉素100mg·L-1的RPMI1640培养基中，37℃、pH7.2置5%CO2培养箱中培养48h，经0.25%的胰酶消化后，制成2×105·ml-1细胞悬液。7　　1.4三叶青黄酮的提取、分离和制备称取三叶青块根1000g，采用碱性稀醇提取法[2]提取得三叶青黄酮7.2g。聚酰胺柱层析[2]后，分别用10%，30%，50%，70%，95%的乙醇洗脱，回收得浓缩物，真空干燥至恒重，分别标记为HT10，HT30，HT50，HT70和HT95

5、。分别称取HT10，HT30，HT50，HT70和HT95各2mg，溶解于200μl二甲基亚砜中，旋涡振荡，全部溶解后，加入800μlRPMI1640培养液旋涡震荡混匀后放置于4℃冰箱保存备用，终浓度为10mg·ml-1。用时按比例配制成2，4，6，8，10mg·ml-1的浓度液。　　2方法　　2.1实验分组实验组分加药组和对照组,加药组分别加入HT10，HT30，HT50，HT70和HT95。各自加入100μl2，4，6，8，10mg·ml-1的药液，每计量组6个复空，对照组加等量的培养基,混匀后放入5%CO2培养箱中培养。　　2.2四氮噻唑蓝(MTT)比色法取对数生长期SM

6、MC-7721细胞,接种于96孔板,每孔加入100μl细胞悬液,培养24h,待细胞贴壁后,进行换液和药物处理[3],弃上清液,加入100μlHT10，HT30，HT50，HT70和HT95各浓度的药液100μl。对照组加100μl的培养液，混匀。37℃、pH7.2置5%CO2培养箱中培养。培养487h后,弃上清液,在各孔中加入5g·L-1MTT30μl,继续培养4h,弃上清液,每孔加二甲亚砜100μl,振摇5min,用酶联免疫检测仪测定570nm处吸光度,计算出细胞抑制率。　　2.3光学显微镜下形态学观察取实验组细胞,用PBS(pH7.2)洗涤1次,做离心涂片,用甲醇固定3～5

7、min，滴加Wright染色2min,入Wright磷酸缓冲稀释液4～10min，用蒸馏水冲洗[3],在油镜下观察细胞形态。　　2.4荧光显微镜观察取实验组细胞,吹打均匀,取30μl悬液加到载玻片上,加10μl吖啶橙染色,加盖玻片后置荧光显微镜下观察SMMC-7721细胞形态并照相,在显微镜下数400个细胞,计算细胞凋亡率[3]。　　2.5DNA琼脂糖凝胶电泳收集药物作用组及对照组培养细胞,常规方法提取细胞DNA,1.5%琼脂糖凝胶孔中电泳,在室温、50V、恒流60mA电泳2h,紫外灯下观察