三羟异黄酮诱导人肝癌细胞SMMC7721凋亡的分子机制研究

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1、中文摘要三轻异黄酮诱导人肝癌细胞SMMC-7721凋亡的分子机制研究摘要原发性肝癌是全球发病率和死亡率均较高的恶性肿瘤之一，在我国已成为第二大癌症杀手。近年来肝癌的发病率有逐步上升趋势，严重威胁着人民的健康和生命。肝癌的发生是涉及多因素、多步骤、进行性发展的复杂过程，受环境和遗传等多重因素的影响。当前手术治疗仍然占据主导地位，但由于肝癌多合并肝硬化和早期肝内转移，手术治疗切除率低且复发率高，另外由于肝癌患者对毒副反应大的化疗药物耐受力差，因此从天然动植物中寻找毒性低、疗效高的抗癌活性成分成为近年来国内外肝癌治疗研究的热点。三轻

2、异黄酮是大豆中具有高效低毒特性的抗癌活性成份，广泛存在于大豆、水果和其他植物中。流行病学调查发现，高消耗大豆的亚洲居民的性激素相关肿瘤如乳腺癌、前列腺癌等的发病率较西方国家低。进一步的研究证实，大豆中的三经异黄酮作为一种蛋白酪氨酸激酶抑制剂和植物雌激素，可抑制多种肿瘤如乳癌、前列腺癌、胃癌、结肠癌等的生一长，其可能的抗癌机理包括:弱的雌激素样作用及拮抗雌激素作用;诱导肿瘤细胞的凋亡;调节细胞周期，使细胞阻滞于Gz/M期;抑制酪氨酸蛋白激酶的活性和抑制各种生长因子及其受体的磷酸化;增强抗氧化酶的活性，抑制过氧化氢的生成;抑制DN

3、A拓扑异构酶11的活性;抑制肿瘤的血管形成和转移;抑制肿瘤对某些化疗药物的耐药等。其中一一一1中文摘要诱导肿瘤细胞的凋亡是其主要作用机制。众所周知，细胞凋亡在肝癌的发生发展中发挥重要作用，细胞凋亡是基因调控下的细胞主动死亡过程，可引起DNA损伤、有丝分裂纺锤体功能紊乱、代谢失调等口形态上主要表现为细胞皱缩、胞浆减少、核碎裂、凋亡小体形成等，细胞的基因组DNA被分解成180-200bp的规则片段，凝胶电泳可出现特征性的梯状条带。细胞凋亡存在复杂的调节网络，有许多基因和信号蛋白分子参与了细胞凋亡的调控过程，如Fas/FasL、胞浆

4、信号转导蛋白、Caspases家族和Bcl-2家族等。死亡受体Fas为一种I型膜表面糖膜蛋白，当受到外源性信号刺激后，与细胞表面的FasL结合，使细胞具有很强的诱导凋亡作用。Bcl-2家族是细胞凋亡的重要调解者，系通过阻断凋亡的公共信号传递通路而诱导凋亡。p53是重要的抑癌基因，与细胞周期的调控和凋亡的调控密切相关，p53可对损伤的DNA进行修复，如修复失败则诱导损伤细胞发生凋亡，从而防止肿瘤的发生，而p53突变后则失去抑制细胞增殖、启动肿瘤细胞凋亡的作用，与肝癌等多种肿瘤的发生关系密切。生存素Survivin是近来发现的细胞

5、凋亡抑制基因，在几乎所有恶性肿瘤中均有高表达，而在分化良好的正常组织却无表达，Survivin具有抑制细胞凋亡和影响细胞分裂的双重作用，研究认为Survivin在肝癌中的高表达与其凋亡受阻有关。Caspase-3在细胞凋亡过程中是非常关键的效应分子，通过级联反应最终降解底物，促使细胞凋亡。基于以上理论，诱导癌细胞凋亡成为肝癌治疗的新途径。早期的研究发现三轻异黄酮能诱导白血病细胞的凋亡，中文摘要进一步的体外研究证实三经异黄酮能使多种肿瘤细胞受阻于G2/M期，诱导癌细胞的凋亡，伴随凋亡相关基因Bel-2家族、Fas,p53,环氧合

6、酶COX-2、细胞周期负性调节因子p21等的改变，但其具体的作用靶点和分子机制尚未完全阐明。目前，国内外关于三轻异黄酮对肝癌的抑制作用研究尚乏报道，通过细胞培养发现其可诱导肝癌细胞凋亡，但其诱导凋亡的分子机制尚未明了。本研究通过体外细胞培养和分子生物学技术，检测人肝癌细胞SMMC-7721凋亡过程中相关蛋白基因的表达，旨在探讨三轻异黄酮诱导肝癌细胞凋亡的分子机制。目的:探讨三轻异黄酮诱导人肝癌细胞SMMC-7721凋亡的分子机制。方法:应用体外人肝癌细胞系SMMC-7721细胞培养技术，采用MTT法观察三轻异黄酮对肝癌细胞的增

7、殖抑制作用，选择合适的实验剂量。HE染色观察凋亡细胞的形态学表现，琼脂糖凝胶电泳观察凋亡细胞的DNALadder。采用细胞免疫组化检测三经异黄酮诱导人肝癌细胞凋亡过程中相关蛋白p53,Caspase-3,Survivin的表达，采用RTPCR法检测Caspase-3,Survivin在基因水平的表达。结果:①三轻异黄酮对SMMC-7721细胞生长的影响:与培养基对照组相比，各种体积分数DMSO在24,48,72h对肝癌细胞未发现有明显抑制作用(P>0.05)，可以排除溶剂对实验的影响。实验组在24h后，2.5,5,10l.g-

8、mL-，三经异黄酮组对SMMC-7721细胞的抑制作用不明显(P>0.05),20,40pg-mL-’组的抑制作用与对照组比较差异才有一一-一一一一3中文摘要显著性(P<0.05)a48,72h后5,10,20gg-mL-，浓度的三轻异黄酮对肝癌细胞均有抑制作用，且随浓度增加