β射线诱导人肝癌细胞凋亡

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1、β射线诱导人肝癌细胞凋亡【关键词】188,Re　　关键词:188Re;凋亡;β射线;肝癌细胞　　0引言　　凋亡或细胞程序性死亡是一种不同于细胞坏死的死亡方式，是在基因控制下的有序死亡，是一个主动性自杀过程，常伴有特征性形态学和生化变化.临床上放射线治疗肿瘤主要应用射线诱导细胞凋亡这一机制.188Re发射2110KeV的β射线，155KeVγ射线，半衰期17h，具有良好的核物理性质.国外188Re的研究主要在188Re标记单克隆抗体对肿瘤的放射免疫治疗，并显示具有一定的疗效，而国内关于188Re的研究较少，经文献检索未见有关于188Re诱导细胞凋亡的报道.本实验旨在

2、研究188Re-β射线诱导人肝癌细胞系hHCC（humanhepatomacarcinomacell，人原发性肝癌细胞）凋亡的形态学变化、细胞周期，以探讨其发生机制.　　1材料和方法　　1.1材料吖啶噔染料（AO染料），美国Amersco公司.188Re可由188-2000EX电子显微镜.　　1.2方法　　1.2.1细胞培养方法hHCC（中科院上海细胞所细胞库）培养于含100mL・L-1小牛血清的RPMI1640培养瓶中，培育箱37℃，含50mL・L-1CO2.1.2.2吖啶噔染色标本的制备10mg吖啶噔加入100mLPBS，溶解、过滤

3、、4℃避光保存.用6孔板接种hHCC，每孔1×105;在另一板上设阴性对照，即只加细胞不加放射性核素188Re，分箱培养.以7.4，11.1，14.8，18.5和22.2MBq188Re分别加入hHCC培养孔中，培养72h，将细胞消化吹下，制备成细胞悬液，取95μL细胞悬液，加入5μL吖啶噔储存液，混匀，吸一滴混合液滴在载玻片上，加上盖玻片，荧光显微镜下观察、照相.　　1.2.3透射电镜标本的制作hHCC1×105接种于培养瓶中，培养24h，换液，加入188Re11.1MBq，继续培养72h.弃培养液，将细胞消化下来，以1000r・min-1离心8m

4、in，弃上清，加入30mL・L-1戊二醛固定，然后加入10mg・L-1锇酸固定，再经程序脱水、渗透、环氧树脂包埋、超薄切片、铅铀染色，透射电镜下观察.　　1.2.4流式细胞仪标本的制作hHCC以1×105接种于培养瓶中，培养24h，换培养液，分别加入3.7，7.4，11.1，14.8，18.5和22.2MBq188Re，培养72h，另设阴性对照细胞，分箱培养.将细胞消化下来，PBS洗2遍，调整成1×109・L-1单细胞悬液，取1mL细胞再加2mL4℃无水乙醇，吹散混匀，封口膜4℃保存24h以上.上流式细胞仪前，用PBS再洗

5、一次，加碘化丙锭染色，测定DNA含量变化，分析细胞凋亡和细胞周期情况.　　2结果　　2.1荧光显微镜形态观察hHCC经不同剂量188Re照射后，细胞出现凋亡、死亡现象.正常细胞的细胞核DNA呈黄绿色均匀荧光，细胞质为橘黄色荧光，凋亡细胞的胞核或细胞质内可见致密浓染的黄绿色荧光，甚至有黄绿色凋亡小体，坏死细胞的细胞质内黄绿色荧光均减弱甚至消失.阴性对照的细胞核形态完整、清晰，呈均匀的黄绿色荧光，胞核中有空泡，细胞质为橘黄色，形态完整.7.4MBq剂量细胞大致完整，胞核清楚，胞膜清晰无破裂，坏死细胞少见，细胞内荧光基本如对照组，染色均匀，凋亡细胞少见，11.1，14.

6、8MBq剂量组黄绿色深染的凋亡细胞较多，如图1示其胞核或细胞质内可见致密浓染的黄绿色荧光颗粒，甚至可见整个细胞固缩，明显的黄绿色致密浓染的荧光，分不清胞核与胞质，另见与胞体脱离的黄绿色浓染的数个凋亡小体呈圆形，细胞膜有伪足样突起.18.5，22.2MBq细胞大多死亡，死亡细胞黄绿色荧光减弱，染色浅淡，坏死细胞大多破裂，胞质流失，细胞形态不规则（图2）.　　2.2电镜观察凋亡肝癌细胞微绒毛脱失，染色质固缩并凝结成块边集，细胞浆浓缩，内质网疏松与胞膜融合，形成一个个空泡.线粒体缩小，结构无明显变化（图3）.　　图1－图3略　　2.3流式细胞仪分析凋亡细胞一个标志是，在

7、正常细胞G1峰前面出现一个DNA含量减少的“G1亚峰”，用流式细胞仪分析阴性对照，3.7，7.4，11.1，14.8，18.5和22.2MBq细胞周期结果（图4）.　　荧光显微镜观察表明在阴性对照和7.4MBq剂量组，细胞基本正常，胞核完整，黄绿色荧光染色均匀，细胞质为橘黄色，胞膜无破裂，凋亡少，死亡细胞少，说明剂量低时不足以诱导细胞大量凋亡，在11.1，14.8MBq剂量组凋亡细胞出现最多，在18.5，22.2MBq时可见细胞呈雪花状大片坏死，这说明大剂量照射后细胞凋亡和其他形式的细胞死亡是造成细胞减少的共同原因，也说明合适的照射剂量可诱导细胞凋亡而不致其死亡，

8、表明188