bvdv诱导mdbk细胞产生凋亡的分子机制研究

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1、分类号：密级：学号:2010108024单位代码：10759石河子大学硕士学位论文BVDV诱导MDBK细胞产生凋亡的分子机制研究学位申请人王讲德指导教师陈创夫教授指导小组教师张辉副教授申请学位门类级别农学硕士学科、专业名称基础兽医学研究方向动物疾病病理学所在学院动物科技学院中国新疆石河子2013年6月ResearchonthemechanismofapoptosisofMDBKcellsinducedbyBVDVADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartiaLFuL

2、fiLLmentoftheRequirementsFortheDegreeofMasterofAgricultureByWangJiang-de(BasicVeterinaryScience)DissertationSupervisor:Prof.ChenChuangfuAssociateProf.ZhangHui课题来源国际合作项目项目名称：牛病毒性腹泻粘膜病防制新技术课题编号：2013DFR30970国家自然科学基金项目项目名称：牛病毒性腹泻病毒囊膜蛋白E2与牛胚胎滋养层细胞相互作用的分子机制研究课题编号：311

3、01816学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是在我导师指导下进行的研究工作及取得的科研成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已发表和撰写过的科研成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示感谢。研究生签名：时间：年月日学位论文版权授权书本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门和指定机构送交论文的电子版或纸质版。有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索。有权将论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用

4、本规定。研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日中文摘要[目的]牛病毒性腹泻病毒（bovineviraldiarrheavirus，BVDV）属于黄病毒科瘟病毒属的负链RNA病，该病毒主要引起腹泻、持续性感染、免疫抑制和母畜流产等主要症状。目前随着我国养牛业的快速发展，给我国的畜牧业发展带来了严重损失。根据BVDV能否在培养的细胞中产生致细胞病变的效应，将其分为致细胞病变BVDV（cpBVDV）和非致细胞病变BVDV(ncpBVDV)两种生物类型，其中cpBVDV能够使宿主细胞产生凋亡。探讨cpBVDV诱导宿主

5、细胞产生凋亡的机制有助于我们开发针对病毒感染高效的生物治疗方法。[方法]（1）构建MDBKCs和BMDBKCs两个样品的cDNA文库，结合Solexa高通量测序技术和生物信息学方法鉴定miRNA的表达谱，利用qRT-PCR对表达差异显著的miRNA（miR-129-3p、miR-33a、miR-532、bno-miR-2、bno-miR-69和bno-miR-160）进行验证；（2）荧光显微镜观察cpBVDV感染的MDBK细胞形态变化，利用流式细胞仪检测感染细胞凋亡率；(3)利用qRT-PCR检测cpBVDV感染的M

6、DBK细胞中miR-33a的表达水平；(4)利用Targetscan软件预测miR-33a的靶基因，构建重组载体pMD18-MAP3K33'UTR和双荧光素酶重组表达载体pmirGLO-MAP3K33'UTR，限制性核酸内切酶SACI/XHOI进行双酶切鉴定并测序，双荧光素酶基因检测法进行靶基因验证；(5)qRT-PCR检测转染miR-33aNC(阴性对照)和miR-33amimics的MDBK细胞中miR-33a的表达水平；(6)采用qRT-PCR和Westernblot分别检测靶基因MAP3K3和抗凋亡基因BCL

7、-2的转录水平以及蛋白水平；(7)利用流式细胞仪检测转染细胞的凋亡率。[结果](1)鉴定出221个已注释miRNAs和239个新miRNAs以及miRNAs的表达谱，qRT-PCR验证结果与Solexa高通量测序结果基本一致;(2)cpBVDV感染的MDBK细胞形态发生改变，细胞凋亡率随感染时间延长而升高;(3)cpBVDV感染的MDBK细胞中miR-33a的表达水平升高;（4）获得miR-33a的靶基因MAP3K3，重组载体pMD18-MAP3K33'UTR和双荧光素酶重组表达载体pmirGLO-MAP3K33'U

8、TR构建成功，miR-33a可直接靶向MAP3K3;(5)转染miR-33amimics的MDBK细胞中miR-33a的表达水平随时间延长而升高;(6)转染miR-33amimics的MDBK细胞中靶基因MAP3K3和抗凋亡基因BCL-2的转录水平和蛋白水平均显著降低;(7)转染miR-33amimics的细胞凋亡率明显升高。[结论]以上结果表