高尿酸血症诱导胰岛β细胞凋亡分子机制研究.pdf

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1、分类号：R589.7密级：公开学校代码：11065学号：2015010033学术博士学位论文高尿酸血症诱导胰岛β细胞凋亡分子机制研究作者姓名路杰指导教师李长贵教授学科内科学（内分泌与代谢病）培养单位医学部临床医学系答辩日期2018年5月17日高尿酸血症诱导胰岛β细胞凋亡分子机制研究摘要目的：1、揭示自发性高尿酸血症小鼠模型其糖代谢相关表型；2、探究高尿酸血症促糖尿病发生发展的可能机制，分析并确定该机制中的候选基因，以期揭示高尿酸血症与胰岛β细胞损伤之间的分子学关联；3、验证高尿酸血症诱导胰岛β细胞损伤及Nrg4基因在此过程中的分子机制。方法：表型研究方面：1、应用TAL

2、EN靶向基因修饰技术敲除C57BL/6小鼠体内Uricase基因，构建自发性高尿酸血症的小鼠模型。2、应用血糖试纸和胰岛素ELISA试剂盒分别测定构建自发性高尿酸血症的小鼠的空腹血糖及空腹胰岛素检测；对其进行葡萄糖耐量实验、胰岛素耐量实验和葡萄糖刺激的胰岛素分泌实验，以揭示自发性高尿酸血症的小鼠糖代谢表型及胰岛细胞的功能；对小鼠胰岛组织行病理学实验（HE染色，免疫组化）以研究其胰岛组织的形态学改变。3、基于自发性高尿酸血症小鼠的糖代谢表型，应用多次低剂量链脲佐菌素诱导方法，诱发糖尿病的发生，比较自发性高尿酸血症小鼠和其对照组小鼠之间糖尿病发生率的差异，应用病理学实验（H

3、E染色，免疫组化）比较其胰岛组织的形态学改变及胰岛β细胞阳性数量的差异，结合末端脱氧核苷酸转移酶脱氧尿苷三磷酸切口末端标记和免疫组化实验，特异性检测胰岛β细胞的凋亡情况。机制研究方面：1、提取多次低剂量链脲佐菌素诱导后的胰岛组织，行microarray微阵列芯片，筛查出有差异的转录组基因。应用系统生物信息学，从多个角度分析高尿酸血症促糖尿病发生发展机制中的候选基因。应用GeneOntology和KEGGpathway富集分析寻找差异基因生物学功能及功能通路；应用人群尿酸相关全基因组关联分析数据，联合Locuszoom在线分析平台，输入microarray结果前20个差异

4、表达基因，对比发现候选基因；应用基于数据的复杂疾病基因优选表达分析软件分析胰岛组织中可能表达的基因；于String数据库中搜索与凋亡信号通路中的基因。2、应用RT-PCR，验证microarray在自发性高尿酸血症小鼠的胰岛组织中筛选出的差异基因表达水平；应用RT-PCR和Westernblot体外验证尿酸刺激组和对照组Min6胰岛β细胞中差异基因的表达；应用流式细胞仪配合AnnexinV/PI凋亡检测试剂盒测定尿酸刺激组与对照组凋亡情况；应用胰岛素ELISA试剂盒测定尿酸刺激组与对照组上清液胰岛素分泌水平。3、构建INrg4过表达的Min6细胞系，检测尿酸刺激下Min

5、6细胞凋亡情况以及胰岛素分泌情况。结果：表型研究方面：1、Uricase基因敲除小鼠无论性别，尿酸值均明显高于同窝野生型小鼠，自发性高尿酸血症小鼠模型构建成功。2、Uricase基因敲除小鼠无论性别，空腹胰岛素及空腹血糖值与同窝野生型小鼠相比，均无明显差异。糖耐量实验中，Uricase基因敲除雄性小鼠于葡萄糖注射15分钟及30分钟时，血糖值明显高于其野生型对照小鼠，而雌性小鼠间则无明显差异。胰岛素耐量实验结果显示，Uricase基因敲除小鼠无论性别，血糖值与同窝野生型小鼠相比均无明显差异。体内GSIS实验结果显示，Uricase基因敲除雄性小鼠于低糖刺激时胰岛素分泌值与

6、同窝野生型小鼠无明显差异，而在高糖刺激时，则明显低于同窝野生型小鼠。体外GSIS实验与体内GSIS实验结果一致，即Uricase基因敲除雄性小鼠分别于葡萄糖刺激15分钟和30分钟后，胰岛素分泌值则明显低于同窝野生型小鼠。病理学实验显示，Uricase基因敲除雄性、雌性小鼠胰岛形态及β细胞比例与同窝野生型小鼠均无明显差异。3、Uricase基因敲除雄性小鼠于STZ腹腔注射后第2天血糖值明显高于STZ诱导的同窝野生型小鼠。STZ诱导后Uricase基因敲除小鼠无论性别，糖尿病发生率均明显高于同窝野生型小鼠。相比于雌性小鼠，雄性小鼠具有更高的糖尿病发生率。病理学结果显示，ST

7、Z诱导后Uricase基因敲除小鼠相较于野生型小鼠，胰岛形态萎缩，胰岛β细胞比例减少，胰岛β细胞体量明显降低。4、提取胰腺组织，特异性检测其胰岛β细胞凋亡情况，实验结果显示，相比于同窝野生型小鼠，STZ诱导后的Uricase基因敲除小鼠胰岛β细胞TUNEL阳性细胞数明显升高，凋亡情况更严重。机制研究方面：1、STZ诱导的WT和KO两组存在多个差异表达基因，其中KO组相比于WT组下调基因占大多数。对芯片结果中对差异表达前六位的基因行RT-PCR验证，结果显示，所有基因表达方向（上调/下调）与芯片结果一致。Pck1、Nrg4、Ucn3和Cox