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1、三叶青黄酮诱导SMMC张立明，樊瑞军，杨凤琴【摘要】目的观察三叶青黄酮对SMMC-7721肝癌细胞诱导凋亡的作用。方法通过四氮噻唑蓝(MTT)比色法检测三叶青黄酮对细胞的抑制增殖作用;光学显微镜、荧光显微镜下形态学观察;DNA琼脂糖凝胶电泳及流式细胞仪(FCM)研究分析三叶青黄酮对肝癌细胞的诱导凋亡作用。结果三叶青黄酮能显著的抑制SMMC-7721肝癌细胞的生长，并具有浓度依赖性。光学显微镜、荧光显微镜下观察,发现细胞凋亡现象;DNA琼脂糖凝胶电泳可见DNA梯形条带;流式细胞仪(FCM)检测分析出现凋亡亚二倍体峰。结论三叶青黄酮对肝癌细胞具有诱导凋亡作用,有抗肝癌的药用价值。【关键词】三叶
2、青黄酮;肝癌细胞;凋亡三叶青具有清热解毒、祛风化痰、活血止痛等功效1，用于治疗高热惊厥、肺炎、哮喘、肝炎、风湿、月经不调及恶性肿瘤，具有很好的疗效。大量的研究表明该中药具有免疫调节作用,其不仅直接作用于细胞免疫，而且通过整体作用来控制细胞免疫与细胞因子的活动。近几年，三叶青黄酮抗肿瘤作用日益受到重视。为进一步探讨三叶青抗肿瘤作用的机制.freela公司产品;四氮噻唑蓝(MTT)，美国Sigma公司产品。1.3细胞株及培养肝癌细胞株SMMC-7721由第四军医大学口腔医学院引进。接种于100L玻璃培养瓶中，在含10%小牛血清、青霉素100mg·L-1、链霉素100mg·L-1的RPMI164
3、0培养基中，37℃、pH7.2置5%CO2培养箱中培养48h，经0.25%的胰酶消化后，制成2×105·ml-1细胞悬液。1.4三叶青黄酮的提取、分离和制备称取三叶青块根1000g，采用碱性稀醇提取法2提取得三叶青黄酮7.2g。聚酰胺柱层析2后，分别用10%，30%，50%，70%，95%的乙醇洗脱，回收得浓缩物，真空干燥至恒重，分别标记为HT10，HT30，HT50，HT70和HT95。分别称取HT10，HT30，HT50，HT70和HT95各2mg，溶解于200μl二甲基亚砜中，旋涡振荡，全部溶解后，加入800μlRPMI1640培养液旋涡震荡混匀后放置于4℃冰箱保存备用，终浓度为10
4、mg·ml-1。用时按比例配制成2，4，6，8，10mg·ml-1的浓度液。2方法2.1实验分组实验组分加药组和对照组,加药组分别加入HT10，HT30，HT50，HT70和HT95。各自加入100μl2，4，6，8，10mg·ml-1的药液，每计量组6个复空，对照组加等量的培养基,混匀后放入5%CO2培养箱中培养。2.2四氮噻唑蓝(MTT)比色法取对数生长期SMMC-7721细胞,接种于96孔板,每孔加入100μl细胞悬液,培养24h,待细胞贴壁后,进行换液和药物处理3,弃上清液,加入100μlHT10，HT30，HT50，HT70和HT95各浓度的药液100μl。对照组加100μl的培
5、养液，混匀。37℃、pH7.2置5%CO2培养箱中培养。培养48h后,.freelin,用酶联免疫检测仪测定570nm处吸光度,计算出细胞抑制率。2.3光学显微镜下形态学观察取实验组细胞,用PBS(pH7.2)洗涤1次,做离心涂片,用甲醇固定3～5min，滴加MC-7721细胞形态并照相,在显微镜下数400个细胞,计算细胞凋亡率3。2.5DNA琼脂糖凝胶电泳收集药物作用组及对照组培养细胞,常规方法提取细胞DNA,1.5%琼脂糖凝胶孔中电泳,在室温、50V、恒流60mA电泳2h,紫外灯下观察并照相3。2.6流式细胞仪(FCM)分析将经药物处理的细胞，1000r·min-1离心5min，弃上清
6、液，PBS洗涤2次，1000r·min-1离心5min，弃上清液，加冷的70%(体积分数)乙醇4℃固定24h，离心，弃乙醇，PBS洗1次，1000r·min-1离心5min，弃上清液，滴加0.5ml100mg·L-1RNase，放置4h，离心，弃上清液，PBS洗1次，300目筛网过滤1次，1000r·min-1离心5min，弃上清液，加0.5mlPI过夜3。上流式细胞仪测定。2.7统计学处理采用SPSS11.0软件,不同药物浓度组间的比较采用完全随机设计的方差分析,各药物浓度组与对照组的比较采用Duntt检验,以α=0.05为检验水准。3结果3.1三叶青黄酮对SMMC-7721肝癌细胞增殖
7、的抑制作用结果见图1。从图1可以看出,不同浓度乙醇层析分离的三叶青黄酮(HT10、HT30、HT50、HT70和HT95)均能抑制SMMC-7721细胞的增殖;随着药物浓度的增加,其生长抑制作用增强,呈浓度-效应关系。其中HT50作用最强,随着加入药物浓度的增加,其对SMMC-7721细胞生长抑制率分别为38.6%，47.2%，65.1%，70.1%和71.6%。图1三叶青黄酮对SMMC-7721肝癌细胞增殖抑制作用3.
