三叶青愈伤组织诱导及分化培养基筛选.doc

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1、摘要以三叶青不带腋芽的茎段为外植体，采用正交试验的方法研究了不同培养基和激素水平对三叶青愈伤组织诱导及不定芽分化的影响。结果表明，以培养基ms+6-ba2mg/l+iba0.2mg/l最有利于愈伤组织的诱导，20d后诱导率为96.7%；以培养基b5+6-ba2mg/l+naa1.0mg/l最有利于不定芽的分化，40d后分化率为66.7%。　　关键词三叶青；愈伤组织；诱导；分化；培养基；筛选　　中图分类号s567.23+9文献标识码a文章编号1007-5739（2011）21-0121-02　　selectionofmediumfordifferentiationandcallusinduct

2、ionoftetrastigmahemsleyanum　　（zhejiangpharmaceuticalcollege，ningbozhejiang315100）　　三叶青（tetrastigmahemsleyanum）又名金钱吊葫芦，是葡萄科多年生蔓生藤本植物，以块根或全草入药，是我国独有的珍贵物种。其主要活性成分黄酮可用于治疗高热、扁桃体炎、肝炎、风湿性关节炎及病毒性脑膜炎等多种疾病，也是抗肿瘤常用药物[1-2]。三叶青对生长环境的要求非常苛刻，近年来，随着自然环境恶化以及人们无序的采挖，致使野生三叶青资源已濒临灭绝。　　目前，对三叶青的研究主要集中在其药理作用上，而关于三叶青的组织培养

3、研究尚少见报道[3-4]，且都是以带腋芽的茎段为外植体，繁殖系数较低。另外，培养基的组分都是以单因素水平来设计的，无法准确了解多因素的相互作用。本研究以不带腋芽的茎段为外植体，选择不同的培养基和激素配比进行正交试验，以筛选出愈伤组织诱导和芽分化的较佳培养基，从而为三叶青的快速繁殖提供新途径。1材料与方法　　1.1试验材料　　试验材料采自浙江省丽水市，经安徽师范大学生命科学学院周守标教授鉴定为三叶青，外植体取不带腋芽的幼嫩茎段。　　1.2试验设计　　1.3试验方法　　取新鲜采集的幼嫩茎段，用自来水冲洗2h，然后在无菌超净台上用8%naclo消毒5min后，无菌去离子水清洗6次，再用0.1%hg

4、cl2消毒5min，取出，用无菌去离子水清洗8次，用无菌吸水纸吸干水分，剪成1.5～2.0cm2小块，接种到各愈伤组织诱导培养基上。接种20d后观察统计愈伤组织诱导率及生长状况，愈伤组织经原诱导培养基继代培养2次后转入分化培养基诱导不定芽，40d后统计分化率。以上各培养基均分别加入3%的蔗糖和0.8%的琼脂，ph值为5.8，（26±2）℃培养，光照强度2000lx，光照周期12h/d，每个处理接种10瓶，每瓶接种3个外植体，重复3次。本研究中正交设计及所有数据的统计分析均使用正交设计助手ⅱv3.1软件。　　2结果与分析　　2.1不同培养基类型与激素水平对愈伤组织诱导率及生长状况的影响　　愈伤

5、组织继代培养2次后转入分化培养基中，14d左右少部分愈伤组织上出现绿色芽点，继而形成不定芽。正交试验方案及40d后统计结果见表3，各处理愈伤分化率差异较大，正交试验方差分析结果见表4。从表4可以看出，不同激素浓度对诱导率影响的极差r顺序为：naa>培养基类型>6-ba，促进愈伤组织产生的最佳处理组合是b5+6-ba2mg/l+naa1.0mg/l，即为表3中的4号培养基，在此培养基上，不定芽分化率最高，达到66.7%，而且丛生芽生长密集（图2），芽长势良好，利于后期分割到单芽生长成不定苗（图3）。因此，愈伤组织芽分化的适宜培养基组合为b5+6-ba2mg/l+naa1.0mg/l。　　3结论

6、与讨论　　本试验不同阶段培养基中外源性激素的种类和浓度配比事先均做过系统考察，正交试验激素质量浓度是在单因素试验的基础上选取效果较好的激素质量浓度进行设计的。前期试验结果表明iba是最有利于三叶青愈伤组织诱导的外源性生长素，诱导率高且愈伤的褐化最轻；而在分化培养基中加入浓度大于1mg/l的iba，外植体上有不定根的发生，从而抑制芽的分化。因此，选择naa作为分化培养的外源性生长素。　　在植物组织培养中，植物的愈伤组织诱导和器官分化主要决定于植物体内细胞分裂素和生长素激素的比例，6-ba可以有效地诱导愈伤的产生与芽的萌发，本试验中当6-ba浓度超过4.0mg/l时愈伤组织褐化明显加重，影响愈伤

7、组织的继代培养，仅采用浓度1～4mg/l的6-ba也能诱导愈伤组织的产生，但同时添加少量iba的培养基中愈伤组织诱导率明显高于未添加iba的培养基，说明少量的iba对促进愈伤组织的形成有协同作用，尤以iba0.2mg/l效果为佳。　　不定芽的分化中选择6-ba和naa浓度组合作为主要的研究因素。单独使用6-ba诱导不定芽分化，外植体上仅有愈伤组织的形成，没有不定芽的出现；而将6-ba与生长素naa配合起来用，