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1、响应曲面法优化三叶青总黄酮提取工艺研究论文张立明，张霞，郑传莉，董雪【摘要】目的研究乙醇溶剂提取三叶青中总黄酮的最佳工艺条件。方法以乙醇溶液为提取溶剂，采用响应面设计方法，对影响总黄酮提取效果的3个因素乙醇浓度(C)、液料比(R)、提取时间(t)进行中心组合设计试验，并建立数学模型，研究这些因素对黄酮提取率的影响。结果中心组合设计试验建立总黄酮提取率与乙醇浓度(C)、液料比(R)及提取时间(t)间的数学模型显著.freell/g)，提取时间2.2h;经提取次数考察，最佳提取次数为2次。该条件下三叶青总黄酮的提取率为0.30%。结论验证试验结果表明，应用响应面方法优选出的工艺稳定、合理、
2、可行。【关键词】三叶青;总黄酮;响应面优化;提取工艺三叶青RadixTetrastigmae为葡萄科植物三叶崖爬藤TetrastigmahemsleyanumDielsetGilg的干燥块根,分布于我国浙江,江西,福建,台湾,湖北,广东,广西,四川,贵州及云南等省区1，具有清热解毒、祛风化痰、活血止痛的功能,主要用于治疗高热惊撅、肺炎、哮喘、肝炎、风湿、咽痛、瘰疬,痈疔疮疖等症2。在民间三叶青用于肿瘤的治疗有很好的治疗作用并基本无毒。三叶青提取物(ERT)主要含有淀粉、还原糖、黄酮类、甾体类化合物和氨基酸等。在急慢性肝损伤、肝炎、肝癌的现代药理研究中发现，ERT中主要的生物活性物质为槲
3、皮素、山萘酚、山萘酚-3-O-新橙皮糖苷等黄酮类化合物3。响应面分析法(ResponseSurfaceMethology，RSM)是近几年发展起来的一种分析方法，其原理是通过一系列确定性试验拟合一个响应面来模拟真实的极限状态曲面,从而很容易地进行可靠性分析4。响应面分析法采用多元二次回归方法作为函数估计的工具,.freelg，用体积分数为30%的乙醇溶解并定容至25ml量瓶,摇匀,得浓度为0.236mg/ml的芦丁标准溶液。2.2标准曲线的绘制分别准确吸取芦丁标准溶液0.0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5ml于25ml容量瓶，加入0.1mol/LAlCl3·6H2O2.0ml,
4、用30%乙醇定容至刻度，摇匀,室温放置15min后，以试剂空白为参比液,于410nm处测定吸光度值。以测得的各比色液的吸光度A对相应的芦丁质量浓度C作标准曲线，得到该曲线的线性回归方程为A=26.98C+0.0004,线性范围为0.00472～0.0236mg/ml，相关系数R=0.9995。2.3样品中总黄酮的提取精密称取4.0g三叶青样品,按提取条件热回流提取一定时间后,趁热过滤,将滤液转至100ml容量瓶，加提取溶剂定容至刻度，摇匀，作为待测溶液。2.4样品中总黄酮的含量测定供试品溶液的制备：准确吸取待测液3ml于25ml容量瓶中,按“2.2”项步骤进行测定。根据标准曲线的回归方
5、程导出样品中总黄酮的含量(%)=(A-0.0004)×25.0×10026.98×3.0×m×100%其中:A-吸光度;m-称取的样品质量(mg)2.5单因素实验以总黄酮含量为考察指标,按“2.3”项方法提取后“2.2”项步骤进行测定。采用单因素法考察药材粒度、提取溶剂、溶剂浓度、料液比、提取时间等因素对三叶青中总黄酮提取率的影响。2.6工艺优化方法在单因素试验结果基础上，采用中心组合试验Box-Behnken(BBD)设计方案，选择提取剂乙醇浓度(%)、液料比(ml/g)以及提取时间(h)3个因素，以+1、0、-1分别代表变量的水平(表1)，进行15个试验点(3个中心点)的响应面分析
6、试验，使用Design-expertsoftl/g范围内，20ml/g时提取率最高。提取时间在0.5~3h范围内，3h时提取率最高，但提取时间超过2h，提取率增加速度趋缓。以乙醇溶液为提取溶剂，提取条件的响应面分析试验设计及结果见表2。试验号1，2，3，4，5，6，7，9，10，11，14，15是析因试验，试验号8，12，13是中心试验。其中析因点为自变量取值在C、R、t所构成的三维顶点;零点为区域的中心点，零点试验重复3次，用以估计实验误差。表2BBD设计和实验结果3.2.2回归分析对试验数据进行响应曲面回归分析。结果见表3。表3实验数据的二次响应面模型和回归分析当“ProbF”值小
7、于0.05时，即表示该项指标显著，而对三叶青总黄酮提取率方差分析(表3)结果表明，对总黄酮提取率所建立的回归模型是显著的。并且该模型的R2=0.9502，说明此模型与实际试验拟合较好，试验失拟项小，因此可用该回归方程代替试验真实点对实验结果进行分析。3.2.3拟合模型的建立以供试液的吸光度(A)为响应值，经回归拟合后，各因子与响应值的回归方程为：A=-0.58453+8.35625E-003C+0.037208R+0.33058t-6.0000
