多西紫杉醇诱导smmc-7721肝癌细胞凋亡中的氧化—抗氧化失衡研究

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1、多西紫杉醇诱导SMMC-7721肝癌细胞凋亡中的氧化—抗氧化失衡研究【摘要】［目的］探讨多西紫杉醇在诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡过程中细胞氧化应激以及氧化—抗氧化失衡情况。［方法］取体外培养的对数生长期SMMC-7721细胞，并将培养细胞暴露于10-8mol/L多西紫杉醇，24h后在荧光显微镜下检测细胞凋亡形态，并利用流式细胞仪测定细胞内活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)以及谷胱甘肽(glutathion，GSH)水平。［结果］SMMC-7721细胞暴露于10-8mol/L

2、多西紫杉醇24h后发生凋亡，细胞内活性氧为68.43%±10.47%，显著高于对照组20.32%±3.52%(P<0.001)。细胞内GSH水平4.5±1.2fmol/cell，显著低于对照组11.5±2.5fmol/cell(P<0.05)。［结论］多西紫杉醇诱导细胞凋亡过程中存在氧化应急以及氧化—抗氧化失衡，ROS可能参与了细胞凋亡的过程。【关键词】多西紫杉醇肝肿瘤细胞凋亡活性氧谷胱甘肽多西紫杉醇是紫杉类抗癌新药，目前多用于治疗非小细胞肺癌、乳腺癌、胰腺癌等恶性肿瘤。研究表明，多西紫杉醇对

3、肝癌细胞有效[1,2]。本文研究了多西紫杉醇诱导SMMC-7721肝癌细胞凋亡作用，并且探讨了在此过程中细胞内活性氧的变化，以期从活性氧角度探讨该药的抗癌作用，为临床上应用多西紫杉醇治疗肝癌提供实验依据。91材料与方法1.1材料本实验在山东大学药理实验室完成，实验用多西紫杉醇(商品名:泰素帝)为安万特公司产品，20mg/支。2′，7′-二氯双氢荧光素二乙酸盐（2′，7′-dichlorodihydrofluoresceindiacetate，DCFH-DA）和二氢乙啶（dihydroethidine，HE

4、）购自Sigma(USA)公司。谷胱甘肽（glutathion，GSH）测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所第一分所。SMMC-7721肝癌细胞由中科院上海细胞生物研究所提供。1.2细胞培养和处理SMMC-7721细胞培养于含10%新生牛血清的RPMI1640(Gibco-BRL)培养液中，细胞置于37℃含5%CO2湿饱和的培养箱中培养，每3d传代一次。取对数生长期SMMC-7721细胞，并将培养的细胞随机分成实验组和对照组。24h后实验组加入含有10-8mol/L多西紫杉醇（本实验中能够完全抑制细胞生长

5、的最低药物浓度）的RPMI1640培养液5ml，对照组加入不含任何药物的RPMI1640培养液5ml，继续培养24h后进行下列实验。1.3荧光显微镜检测细胞凋亡9取实验组和对照组细胞，用0.25%胰蛋白酶消化细胞制成单细胞悬液，PBS洗涤一次，取25μl细胞悬液加1μl吖啶橙和溴化乙啶混合液（吖啶橙100μg/ml和溴化乙啶100μg/ml），细胞浓度1×106/ml，在荧光显微镜下（激发波长490nm）进行观察。1.4细胞内活性氧检测取实验组和对照组细胞各6瓶，向培养液中加入DCFH-DA（终浓度5×1

6、0-6mol/L）和HE（终浓度10-5mol/L）细胞内活性氧捕获剂与细胞一起37℃孵育50min。孵育结束后收集细胞（约1×106）并悬浮于PBS，在BectonDickinsonFACSCalibur流式细胞仪上使用氩离子激光（15mW），以随机波长488nm进行测定。绿色荧光（DCF）对应过氧化物水平通过530nm滤光片收集，而红色荧光(HE)代表超氧阴离子水平通过650nm滤光片收集。取1护细胞在BectonDic-kinsonFACSCalibur流式细胞仪上检测各组荧光强度，激发光为氢离子激

7、光波长488nm，数据采集和分析在PowerMacintosh7600/120计算机上用FAGS/CELLQuest软件(SanJose，CA)。实验组和对照组活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）水平用荧光强度±标准差来表示，两组之间比较用t检验。1.5细胞内GSH含量测定9SMMC-7721细胞传代于培养瓶，实验组用10-8mol/L多西紫杉醇作用24h，对照组未给予多西紫杉醇处理，每组重复3次。用0.25%胰蛋白酶消化细胞并吹打成单细胞悬液，1000r/min离心5min，细胞

8、沉淀用适量生理盐水悬浮，镜下计数。然后1000r/min离心,细胞沉淀加0.75ml蒸馏水再加0.25ml硫代水杨酸溶解，转移至1.5mlEpendorf管，12000r/min离心5min，取上清液检测GSH(试剂盒购自南京建成生物工程研究所第一分所)，操作按试剂盒说明书进行。SMMC-7721细胞内GSH含量用均数±标准差（x±s）表示，实验组和对照组间比较用t检验。2结果2.1荧光显微镜下细胞形态改变SMMC-7721肺