大蓟总黄酮诱导肿瘤细胞凋亡作用的研究

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1、大蓟总黄酮诱导肿瘤细胞凋亡作用的研究作者：刘素君，郭红，潘明，杨志荣，张杰【摘要】　　目的研究大蓟总黄酮对肿瘤细胞凋亡的影响。方法用不同浓度的大蓟总黄酮对人肝癌SMMC-7721和人子宫癌细胞Hela进行处理，MTT法检测细胞活性，再用琼脂糖凝胶电泳观察DNA“梯子”(Ladder)和DAPI染色观察凋亡小体。结果大蓟总黄酮对SMMC-7721的半数致死量(IC50)为μg/ml；对Hela细胞的半数致死量(IC50)为μg/ml。可见清晰的“梯子”状DNA带纹和凋亡小体。结论大蓟总黄酮能诱导癌细胞的凋亡，从而达到抗肿瘤的作用。【关键词】大蓟　总黄酮　抗肿瘤　细胞凋亡　大蓟为菊科管状花亚

2、科菜蓟族蓟属植物CirsiumjaponicumDC.的干燥地上部分或根［1］，多年生草本，高100～150cm，茎直立，密被白毛，叶互生；叶片倒卵状长椭圆形，边缘具浅裂和斜刺，被毛；5～6月开花，头状花序顶生，花单生，紫红色，瘦果扁椭圆形，生于山野路边，以全草和根入药，我国大部分地区有分布。全草灰绿色，大蓟性凉，味甘、苦,归心、肝经，功效为凉血止血、祛瘀止痛，主治吐血、衄血、尿血、血淋、血崩、带下、肠风、肠痈、痈疡肿毒、疔疮、高血压及肝炎等。其化学成分复杂，主要含有黄酮、黄酮苷，挥发油、三萜和甾醇等物质。大蓟在民间验方多用于治疗癌症，如：大蓟根、三白草根治肝癌；鲜大蓟叶与鸡蛋清搅拌后贴

3、于患处，可治乳腺癌等。大蓟的主要成分为黄酮类化合物，文献报道其多聚乙炔具有抗肿瘤作用［2］。其总黄酮在体内有抗肿瘤作用并能提高肿瘤小鼠的免疫功能［3］。但总黄酮对肿瘤细胞诱导凋亡的作用还没有研究，本文就其对肿瘤细胞诱导凋亡的作用进行初步探索。　1材料与仪器瘤株SMMC-7721和Hela细胞株，购自上海细胞生物学研究所。药物：大蓟由成都中药材公司提供。试剂RPMI1640培养基、胎牛血清(FBS)为GIBCO公司产品，染料碘化丙啶(PI)、胰蛋白酶均为Sigma公司产品，四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自上海普飞生物技术有限公司。仪器酶标仪，离心机，倒置显微镜。大蓟总黄酮的制备大蓟总黄酮由本室

4、制备。将大蓟70%乙醇提取物与硅藻土拌样挥干后,装入玻璃管柱中,用石油醚流洗,去除其中的叶绿素和极性较小的成分;流洗结束后倒出硅藻土化合物,挥干溶剂重新装入玻璃管柱,正丁醇流洗提取,用1%三氯化铝乙醇溶液与黄酮类化合物在滤纸上显色后，在紫外灯下观察有无黄绿色荧光的方法检测监控,提取至流洗液无黄酮反应时结束;将正丁醇提取液浓缩后挥干溶剂,用少量95%的乙醇溶解后上聚酰胺树脂柱,依次用水和95%的乙醇洗脱,收集95%的乙醇洗脱液,洗脱至检测无黄酮反应时结束;浓缩95%的乙醇洗脱液,自然干燥,挥干溶剂后得到的成分即为总黄酮成分。紫外分光光度测定其总黄酮为%。总黄酮用DMSO溶解。　2方法.1M

5、TT法检测药物对肿瘤细胞增殖的作用SMMC-7721和Hela细胞株用%胰蛋白酶化后，悬浮于含5%小牛血清的RPMI1640培养液中，用玻璃滴管轻轻吹打成单细胞悬液。取少许细胞悬液于血细胞计数板计数，活细胞数大97%，将细胞株悬液接种于96孔培养板,每孔190μl(含1×104个细胞),2h后，分别加入阴性对照磷酸盐缓冲液(PBS)、阳性对照以及～200μg/mg不同浓度的大蓟黄酮提取液各10μl,3复孔，置于饱和湿度、37℃、5%CO2培养箱中培养7h,然后每孔加入10μlmg/ml的MTT溶液继续培养h，仔细吸去上清液，每孔加入二甲基亚砜150μl。1h后，在570nm波长处用酶标仪

6、测OD值。重复3次并计算抑制率。抑制率(IC)=(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值×100%。.2DAPI染色的染色体DNA的形态分别收集大蓟总黄酮处理细胞和未用药的细胞用定色剂染色10min，10min后用PBS冲洗，细胞再用DAPI液，然后用固定液固定，染色体DNA的形态在荧光显微镜下观察。．3DNA琼脂糖凝胶电泳分别收集大蓟总黄酮和顺铂处理细胞1×10个，按酚、氯仿、异戊醇抽提，乙醇沉淀等常规方法提取细胞总DNA，2％琼脂糖凝胶电泳，紫外透射仪上观察DNA条带。　3结果.1MTT法测试结果用剂量～200μg/mg的大蓟总黄酮处理SMMC-7721和Hela细胞48h后，M

7、TT法测定大蓟黄酮对癌细胞的抑制作用。从图1可以看到，对SMMC-7721和Hela细胞的IC50分别为μg/ml和μg/ml，同空白对照组比较差异极显著。当用剂量～200μg/mg的大蓟黄酮处理SMMC-7721和Hela细胞1，d或d后，对肿瘤细胞的生长，从图2可以看到，活细胞数随着大蓟黄酮浓度的增加而减少。研究结果表明大蓟黄酮对SMMC-7721和Hela细胞的抑制呈剂量和时间依赖性。用大蓟黄酮处理时间越长或剂量越大，对肿瘤细