大蓟总黄酮诱导肿瘤细胞凋亡作用的研究.doc

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1、大蓟总黄酮诱导肿瘤细胞凋亡作用的研宄作者：刘素君，郭红，潘明，杨志荣，张杰【摘要】目的研究大蓟总黄酮对肿瘤细胞凋亡的影响方法用不同浓度的大蓟总黄酮对人肝癌SMMC-7721和人子宫癌细胞Hela进行处理，MTT法检测细胞活性，再用琼脂糖凝胶电泳观察DNA“梯子”（Ladder）和DAH染色观察凋亡小体。结果大蓟总黄酮对S画C-7721的半数致死量（IC50）为ug/ml；对Hela细胞的半数致死量（IC50）为2ug/ml。可见清晰的“梯子”状DNA带纹和凋亡小体。结论大蓟总黄酮能诱导癌细胞的凋亡，从而迗到抗肿瘤的作用。【关键词】大蓟总黄酮抗肿瘤细胞凋亡大蓟为菊科管状花亚科

2、菜蓟族蓟属植物CirsiumjaponicumDC.的干燥地上部分或根［1］，多年生草本，高1⑻〜150cm，茎直立，密被白毛，叶互生；叶片倒卵状长椭圆形，边缘具浅裂和斜刺，被毛；5〜6月开花，头状花序顶生，花单生，紫红色，瘦果扁椭圆形，生于山野路边，以全草和根入药，我国大部分地区有分布。全草灰绿色，大蓟性凉，味甘、苦，归心、肝经，功效为凉血止血、祛瘀止痛，主治吐血、衄血、尿血、血淋、血崩、带下、肠风、肠痈、痈疡肿毒、疔疮、高血压及肝炎等。其化学成分复杂，主要含有黄酮、黄酮苷，挥发油、三萜和甾醇等物质。大蓟在民间验方多用于治疗癌症，如：大蓟根、三白草根治肝癌;鲜大蓟叶与鸡蛋

3、清搅拌后贴于患处，可治乳腺癌等。大蓟的主要成分为黄酮类化合物，文献报道其多聚乙炔具有抗肿瘤作用［2］。其总黄酮在体内有抗肿瘤作用并能提高肿瘤小鼠的免疫功能［3］。但总黄酮对肿瘤细胞诱导凋亡的作用还没有研究，本文就其对肿瘤细胞诱导凋亡的作用进行初步探索。1材料与仪器瘤株S丽C-7721和Hela细胞株，购自上海细胞生物学研究所。药物：大蓟由成都中药材公司提供。试剂RPMil640培养基、胎牛血清(FBS)为GIBC0公司产品，染料璃化丙^(PI)、胰蛋白酶均为Sigma公司产品，四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自上海普飞生物技术有限公司。仪器酶标仪，离心机，倒置显微镜。大蓟总黄酮的

4、制备大蓟总黄酮由本室制备。将大蓟70%乙醇提取物与硅藻土拌样挥干后，装入玻璃管柱中，用石油醚流洗，去除其中的叶绿素和极性较小的成分；流洗结束后倒出硅藻土化合物，挥干溶剂重新装入玻璃管柱，正丁醇流洗提取，用1%三氯化铝乙醇溶液与黄酮类化合物在滤纸上显色后，在紫外灯下观察有无黄绿色荧光的方法检测监控，提取至流洗液无黄酮反应时结束；将正丁醇提取液浓缩后挥干溶剂，用少量95%的乙醇溶解后上聚酰胺树脂柱，依次用水和95%的乙醇洗脱，收集95%的乙醇洗脱液，洗脱至检测无黄酮反应时结束；浓缩95%的乙醇洗脱液，自然干燥，挥干溶剂后得到的成分即为总黄酮成分。紫外分光光度测定其总黄酮为％。总

5、黄酮用DMSO溶解。2方法MTT法检测药物对肿瘤细胞增殖的作用S丽C-7721和Hela细胞株用％胰蛋白酶化后，悬浮于含5%小牛血清的RPMI1640培养液中，用玻璃滴管轻轻吹打成单细胞悬液。取少许细胞悬液于血细胞计数板计数，活细胞数大97%,将细胞株悬液接种于96孔培养板，每孔190ul(含1X104个细胞)，24h后，分别加入阴性对照磷酸盐缓冲液(PBS)、阳性对照以及〜200yg/mg不同浓度的大薊黄酮提取液各10y1，3复孔，置于饱和湿度、37°C、5%C02培养箱中培养72h，然后每孔加入10n15mg/ml的MTT溶液继续培养4h，仔细吸去上清液，每孔加入二甲基

6、亚砜150Pl。lh后，在570nm波长处用酶标仪测0D值。重复3次并计算抑制率。抑制率(1C)=(对照组OD值-实验组OD值)/对照组0D值X100%。DAPI染色的染色体DNA的形态分别收集大蓟总黄酮处理细胞和未用药的细胞用定色剂染色lOmin，lOmin后用PBS冲洗，细胞再用DAPI液，然后用固定液固定，染色体DNA的形态在荧光显微镜下观察。2.3DNA琼脂糖凝胶电泳分别收集大蓟总黄酮和顺铂处理细胞1X105个，按酚、氯仿、异戊醇抽提，乙醇沉淀等常规方法提取细胞总DNA，2%琼脂糖凝胶电泳，紫外透射仪上观察DNA条带。3结果MTT法测试结果用剂量〜200ug/mg的

7、大蓟总黄酮处理SMMC-7721和Hela细胞48h后，MTT法测定大蓟黄酮对癌细胞的抑制作用。从图1可以看到，对S丽C-7721和Hela细胞的IC50分别为Pg/ml和Pg/ml，同空白对照组比较差异极显著。当用剂量〜200ug/mg的大蓟黄酮处理SMMC-7721和Hela细胞1，2d或3d后，对肿瘤细胞的生长，从图2可以看到，活细胞数随着大蓟黄酮浓度的增加而减少。研究结果表明大蓟黄酮对SMMC-7721和Hela细胞的抑制呈剂量和时间依赖性。用大蓟黄酮处理时间越长或剂量越大，对肿瘤细胞的抑制效果就越明显。琼