复方丹参滴丸含药血清诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞

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复方丹参滴丸含药血清诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞作者：武重阳孙兰军赵英强徐强刘晋平【摘要】目的观察复方丹参滴丸含药血清体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞的能力。方法采用全骨髓直接贴壁的方法分离培养大鼠MSCs，流式细胞仪鉴定细胞表面标记;采用复方丹参滴丸的含药血清体外定向诱导第四代MSCs，应用免疫细胞化学法、原位杂交组织化学法、透射电子显微镜鉴定心肌样细胞。结果大鼠MSCs细胞表面抗原CD90、CD106阳性，CD34、CD45、CD31阴性。经复方丹参滴丸含药血清诱导向心肌样细胞分化后，免疫细胞化学法显示α辅肌动蛋白(αActinin)、结蛋白(desmin)强阳性，原位杂交组织化学法显示肌球蛋白重链(MHC)强阳性表达。结论复方丹参滴丸含药血清能促使MSCs分化为心肌样细胞，为中药干预MSCs治疗缺血性心脏病提供干细胞实验依据。【关键词】复方丹参滴丸;骨髓间充质干细胞;心肌样细胞;分化;活血化瘀10 　传统观点认为心肌细胞不能再生，现在的治疗手段和措施通常不能防止左心室重构和心力衰竭的进程。目前认为干细胞可以重塑心肌细胞，有望可以替代坏死心肌组织。Tomita等〔1〕观察了自体骨髓基质细胞移植对大动物心肌再生的作用,结果提示移植细胞可形成岛样心肌细胞,促进血管新生,防止左室重塑,提高局部及全心的收缩功能。通过骨髓间充质干细胞(MSCs)心肌内移植,组织病理学和免疫组化的方法显示输入的干细胞可以分化为心肌样细胞,血管平滑肌细胞和内皮细胞〔2〕,而且能增加血管密度。活血化瘀类中药治疗缺血性心脏病有肯定的疗效，复方丹参滴丸具有抗心肌缺血、缺氧和扩张冠脉作用,临床主要用于治疗冠心病心绞痛。本研究旨在探讨活血化瘀中成药——复方丹参滴丸能否在体外干预大鼠MSCs分化为心肌样细胞，并为诠释活血化瘀类中药治疗缺血性心脏病机制提供动物实验依据。　　1材料与方法　　1.1试剂与器材　　1.1.1试剂DMEM低糖培养基，胎牛血清，0.25%胰蛋白酶(含0.01%EDTA)均为Gibco公司产品，小鼠抗大鼠荧光标记抗体CD34PE(SantaCruz)、CD106PE(Biolegend)，CD31FITC、D45FITC、CD90FITC(Serotec)，阴性对照：小鼠IgG1PE、小鼠IgG1FITC(SantaCruz)。小鼠抗大鼠单克隆抗体sarcomericα辅肌动蛋白(αActinin)、结蛋白(desmin)，肌球蛋白重链原位杂交试剂盒(天津灏洋生物制品科技有限公司)。10 　　1.1.2器材CO2细胞培养箱(ThermoForma)，H600透射电子显微镜(HITACHI)，流式细胞仪(Calibur，美国BectonDickinson公司)，6孔培养板，25cm2、75cm2塑料培养瓶(美国Corning公司)，倒置相差显微镜(Olympus)，Heraeus离心机(D37520，德国Osterode公司)。　　1.1.3实验动物清洁级SD大鼠，雄性，由中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心提供，动物许可证号：scxk津20050001。　　1.2方法　　1.2.1骨髓MSCs的分离扩增100～120g雄性SD大鼠，颈椎脱臼处死，75%酒精浸泡5～10min，无菌条件下取大鼠股骨、胫骨，去除附着于骨表面的组织，去除股骨、胫骨的骨骺，用20mlDMEM冲洗骨髓腔获取骨髓细胞，收集于离心管内，充分吹打制成细胞悬液，1000r/min，20℃离心10min，收集细胞，用20ml完全培养基(DMEM，20%FBS，青霉素G100U/ml、链霉素100U/ml，谷氨酰胺0.2mmol/L)重悬细胞，接种于75cm2的塑料培养瓶中，全程置于5%CO2，37℃，饱和湿度的孵箱中静置培养。3～5d首次换液，以后每隔3～4d换液洗去未贴壁细胞，原代细胞铺满整个培养瓶底面的80%～90%时，用0.25%胰酶(含1%EDTA)按1∶3进行消化传代。10 　　1.2.2MSCs的表面抗原检测取第四代骨髓MSCs，经0.25%胰酶(含1%EDTA)消化，PBS洗涤2～3次，经流式细胞仪检测细胞表面标记。　　1.2.3复方丹参滴丸含药血清制备根据成人日服药量折算成大鼠灌胃剂量，计算大鼠日灌胃剂量54.34mg/kg。将大鼠随机分为实验组和对照组。实验组每日予复方丹参滴丸含药血清灌胃，对照组予等体积蒸馏水灌胃，均连灌7d。每日一次。最后1d灌胃30min后无菌条件下股动脉取血，3000r/min离心15min，分离血清，56℃水浴灭活30min，过滤除菌，-20℃短期保存备用，制备含药血清和空白对照血清。　　1.2.4复方丹参滴丸含药血清诱导MSCs选生长状态良好的P4细胞，每孔以2×104个细胞的浓度接种于6孔培养板中，培养至细胞90%融合后分别诱导，加入含药血清，体积终浓度为20%,作用72h后去除培养基继续培养，同时，设西药组：加入终浓度为5μmol/L的5氮胞苷,预诱导24h后去除培养基;中西药组：加入终浓度为5μmol/L的5Aza,预诱导24h后去除培养基，再与含药血清作用72h去除培养基，继续培养;空白组：加入空白对照血清，体积终浓度为20%，72h后去处培养基，继续培养。倒置相差显微镜下观察7～21d细胞形态变化，进行免疫组化、电镜检测。10 　　1.2.5免疫细胞化学染色诱导后的细胞，用4%多聚甲醛室温固定2h，洗涤后，阻断内源性过氧化物酶，分别滴加1抗αActinin、desmin，4℃过夜，加生物素化兔抗小鼠IgG1第二抗体，37℃45min，PBS液冲洗3次，DAB显色，自来水冲洗，苏木素复染5～10min。PBS洗涤蓝化后，蒸馏水冲洗两次后，37℃空干后，70%甘油封片。以不加一抗作为阴性对照。　　1.2.6透射电镜观察诱导后的细胞经2.5%戊二醛固定，制成电镜标本，透射电镜下观察细胞形态结构。　　1.2.7原位杂交组织化学将诱导培养的细胞，PBS冲洗3次，4%多聚甲醛室温固定2h，加打孔液于细胞培养孔内，封闭内源性过氧化氢酶，PBS洗3次，滴加预杂交工作液和含探针的杂交工作液洗涤后，DAB显色，苏木素复染，细胞质显棕黄色颗粒为阳性反应，70%甘油封片，镜下观察。肌球蛋白重链探针序列：5′GATAGGCGTTGTCAGAGATGGAGAAGAT。　　2结果　　2.1细胞形态学观察及表面标志新鲜制备骨髓细胞悬液可见大量悬浮红细胞，24h后部分细胞贴壁生长，开始为均一的单个圆形，10～1410 d后细胞基本长满瓶底，细胞呈旋涡状生长，细胞为均匀一致的长梭形，胞体中央膨大为扁圆形的细胞核，可见1～3个核仁传代后，细胞变为形态均一的排列有序的成纤维细胞样，长梭形，胞浆突起较少，胞体轮廓不甚清晰，胞体也相对较大。流式细胞仪检测结果提示，大鼠MSCs表达CD90，CD106，但是CD45、CD34和CD31表达阴性。诱导后空白组的细胞形态无显著变化，经过5氮胞苷、复方丹参滴丸含药血清作用后，细胞形态逐渐发生改变。7d后，大约30%～40%MSCs大小逐渐增加，表现为球形，或者在一个方向上逐渐加长，形成类似于棍棒样形状。14d后毗邻的细胞互相连接，排列方向渐趋一致，分别经过5氮胞苷、复方丹参含药血清及二者共同作用的细胞部分发生溶解，21d时可见形成肌管样结构，可见单个核仁，位于细胞的中部。见图1。　　2.2诱导细胞的免疫化学鉴定经复方丹参滴丸含药血清作用21d后，部分细胞表达αactinin和desmin，出现较强阳性表现，其阳性强于西药组和中西药组的细胞。　　2.3透射电镜观察经复方丹参滴丸含药血清诱导后的细胞除胶原蛋白颗粒外，胞浆中可见肌原纤维或肌丝束，密度高低不一，细胞兼有间质细胞和肌细胞特点。见图1。　　2.4诱导细胞的原位杂交化学分析经复方丹参滴丸含药血清作用21d后，部分细胞表达肌球蛋白重链，出现较强阳性表现，其阳性强于西药组和中西药组的细胞。见图1。图1各类MSCs10 　　3讨论　　成体骨髓内包括两种骨髓干细胞：造血干细胞，能产生血液系统所有成熟的谱系;MSCs有时称作基质细胞。MSCs协助骨髓造血干细胞的增殖分化，参与构成造血干细胞的生存和分化环境，对造血干细胞起支持作用〔3〕，具有自我更新和分化为多重谱系的能力，在适当条件刺激下，在体内、体外能够分化为骨、脂肪、软骨〔4，5〕，在体外还可以分化成肌肉组织〔6〕。　　MSCs在体外和体内可以分化成心肌细胞，这些可以从细胞的形态学、自发性搏动或者特殊肌蛋白表达进行鉴定〔7〕，骨髓间充质细胞在体外诱导1w后细胞间形成肌管样结构连接，310 w后表达肌球蛋白、结蛋白、辅肌动蛋白，具有心肌细胞超微结构特征〔7〕。复方丹参滴丸是常用的活血化瘀中成药，是在现代高科技条件下提取丹参、三七的有效成分再加入适量冰片而制成的新型纯中药滴丸剂，其主要成分是丹参、三七、冰片。丹参具有活血化瘀之功效，三七活血化瘀止痛，冰片芳香通窍，活血散结，三药合用共奏活血化瘀、通络止痛之功效，主要用于瘀血阻滞引起的缺血性心脏病的治疗。复方丹参滴丸为速效制剂，其中的丹参素、原儿茶醛、三七皂甙均为水溶性，可直接经黏膜吸收入血、生物利用度及疗效高、无胃肠刺激、无明显毒副作用的特点〔8〕。现代药理研究表明:复方丹参滴丸具有扩张冠状血管，增加冠脉血流量，抑制血小板聚集，降低血脂，调节血液黏稠度，改善微循环，改善心肌缺血缺氧的作用。三七的有效提取成分〔9〕能够诱导大鼠MSCs分化为心肌样细胞，表达Desmin、肌钙蛋白、MHC，叶氏等〔10〕应用双龙方的含药血清干预小型MSCs分化为心肌样细胞，发现蛋白的表达差异可能同中药干预有关。本实验中经过复方丹参滴丸含药血清诱导的细胞部分强阳性表达αActinin、desmin、人肾小球系膜细胞(MHC),电子显微镜下发现细胞胞浆中可见肌原纤维或肌丝束，具有心肌样细胞的特征。空白组则不表达三种蛋白，中西药组和西药组均弱表达αActinin、desmin、MHC，这也提示药物的过多应用不会对疾病的治疗提供肯定的疗效。　　本研究采用了血清药理学的方法，从体外模拟体内药物与细胞相互作用的微环境，初步探讨复方丹参滴丸在体外对干细胞定向诱导分化为心肌样细胞的作用，结果表明活血化瘀类中药复方制剂复方丹参滴丸对促进MSCs修复缺血心肌有重要的应用价值，初步为诠释复方丹参滴丸治疗缺血性心脏病的机制提供了干细胞层次实验依据。【参考文献】　　1TomitaS，MickleDA,WeiselRD,etal.Improvedheartfunctionwithmyogensisandangiogenesisafterautologousporcinebonemarrowstromalcelltransplantation〔J〕.JThoracCardiovascSurg，2002;123(6):113240.10 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