复方丹参滴丸含药血清诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞

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1、复方丹参滴丸含药血清诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞作者：武重阳孙兰军赵英强徐强刘晋平【摘要】目的观察复方丹参滴丸含药血清体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞的能力。方法采用全骨髓直接贴壁的方法分离培养大鼠MSCs，流式细胞仪鉴定细胞表面标记;采用复方丹参滴丸的含药血清体外定向诱导第四代MSCs，应用免疫细胞化学法、原位杂交组织化学法、透射电子显微镜鉴定心肌样细胞。结果大鼠MSCs细胞表面抗原CD90、CD106阳性，CD34、CD45、CD31阴性。经复方丹参滴丸含药血清

2、诱导向心肌样细胞分化后，免疫细胞化学法显示α辅肌动蛋白(αActinin)、结蛋白(desmin)强阳性，原位杂交组织化学法显示肌球蛋白重链(MHC)强阳性表达。结论复方丹参滴丸含药血清能促使MSCs分化为心肌样细胞，为中药干预MSCs治疗缺血性心脏病提供干细胞实验依据。【关键词】复方丹参滴丸;骨髓间充质干细胞;心肌样细胞;分化;活血化瘀10　传统观点认为心肌细胞不能再生，现在的治疗手段和措施通常不能防止左心室重构和心力衰竭的进程。目前认为干细胞可以重塑心肌细胞，有望可以替代坏死心肌组织。Tomit

3、a等〔1〕观察了自体骨髓基质细胞移植对大动物心肌再生的作用,结果提示移植细胞可形成岛样心肌细胞,促进血管新生,防止左室重塑,提高局部及全心的收缩功能。通过骨髓间充质干细胞(MSCs)心肌内移植,组织病理学和免疫组化的方法显示输入的干细胞可以分化为心肌样细胞,血管平滑肌细胞和内皮细胞〔2〕,而且能增加血管密度。活血化瘀类中药治疗缺血性心脏病有肯定的疗效，复方丹参滴丸具有抗心肌缺血、缺氧和扩张冠脉作用,临床主要用于治疗冠心病心绞痛。本研究旨在探讨活血化瘀中成药——复方丹参滴丸能否在体外干预大鼠MSCs分化

4、为心肌样细胞，并为诠释活血化瘀类中药治疗缺血性心脏病机制提供动物实验依据。　　1材料与方法　　1.1试剂与器材　　1.1.1试剂DMEM低糖培养基，胎牛血清，0.25%胰蛋白酶(含0.01%EDTA)均为Gibco公司产品，小鼠抗大鼠荧光标记抗体CD34PE(SantaCruz)、CD106PE(Biolegend)，CD31FITC、D45FITC、CD90FITC(Serotec)，阴性对照：小鼠IgG1PE、小鼠IgG1FITC(SantaCruz)。小鼠抗大鼠单克隆抗体sarco

5、mericα辅肌动蛋白(αActinin)、结蛋白(desmin)，肌球蛋白重链原位杂交试剂盒(天津灏洋生物制品科技有限公司)。10　　1.1.2器材CO2细胞培养箱(ThermoForma)，H600透射电子显微镜(HITACHI)，流式细胞仪(Calibur，美国BectonDickinson公司)，6孔培养板，25cm2、75cm2塑料培养瓶(美国Corning公司)，倒置相差显微镜(Olympus)，Heraeus离心机(D37520，德国Osterode公司)。　　1.1.3实验动物清

6、洁级SD大鼠，雄性，由中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心提供，动物许可证号：scxk津20050001。　　1.2方法　　1.2.1骨髓MSCs的分离扩增100～120g雄性SD大鼠，颈椎脱臼处死，75%酒精浸泡5～10min，无菌条件下取大鼠股骨、胫骨，去除附着于骨表面的组织，去除股骨、胫骨的骨骺，用20mlDMEM冲洗骨髓腔获取骨髓细胞，收集于离心管内，充分吹打制成细胞悬液，1000r/min，20℃离心10min，收集细胞，用20ml完全培养基(DMEM，20%FBS，青霉素G100U/

7、ml、链霉素100U/ml，谷氨酰胺0.2mmol/L)重悬细胞，接种于75cm2的塑料培养瓶中，全程置于5%CO2，37℃，饱和湿度的孵箱中静置培养。3～5d首次换液，以后每隔3～4d换液洗去未贴壁细胞，原代细胞铺满整个培养瓶底面的80%～90%时，用0.25%胰酶(含1%EDTA)按1∶3进行消化传代。10　　1.2.2MSCs的表面抗原检测取第四代骨髓MSCs，经0.25%胰酶(含1%EDTA)消化，PBS洗涤2～3次，经流式细胞仪检测细胞表面标记。　　1.2.3复方丹参滴丸含药血清制备根据成人

8、日服药量折算成大鼠灌胃剂量，计算大鼠日灌胃剂量54.34mg/kg。将大鼠随机分为实验组和对照组。实验组每日予复方丹参滴丸含药血清灌胃，对照组予等体积蒸馏水灌胃，均连灌7d。每日一次。最后1d灌胃30min后无菌条件下股动脉取血，3000r/min离心15min，分离血清，56℃水浴灭活30min，过滤除菌，-20℃短期保存备用，制备含药血清和空白对照血清。　　1.2.4复方丹参滴丸含药血清诱导MSCs选生长状态良好的P4细胞，每孔以2×104个细胞的浓