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1、U0126对实验性脑出血大鼠脑内水通道蛋白4表达的影响作者：张树恒衣服新倪伟民孟飞叶志军【摘要】目的研究水通道蛋白4在出血性脑损伤大鼠脑内的表达,及丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信号转导通路阻滞剂U0126对其表达的影响。方法大鼠缓慢注射自体血出血模型,测定脑组织含水量及伊文斯蓝含量,并采用免疫组织化学，Westernblot检测AQP4的表达。测定预先经尾静脉给予U0126后MAPKs信号通路关键蛋白ERK1/2磷酸化水平,同时观察U0126对脑水肿和AQP4表达的影响。结果假手术组AQP4表达较低，在出血损伤后
2、表达升高,脑组织含水量及伊文斯蓝含量增加,给予U0126后AQP4的表达和脑组织含水量降低,同时ERK1/2磷酸化水平降低。结论出血性损伤后AQP4表达上升,脑水肿明显,预先给予U0126可抑制AQP4的表达,减轻脑水肿。【关键词】脑出血脑水肿水孔蛋白类丁二烯类腈类对于脑水肿的形成,传统观念认为是由于能量耗竭和钙超载所致,9但最近研究发现,AQP4（aquaporin-4,)起着重要作用[1]。水通道蛋白(AQP)是近年来发现的一类涉及特异性细胞膜水分子转运蛋白，是影响水跨膜转运和细胞内外环境平衡调节的主要膜蛋白[2
3、]。AQP家族有十多种类型,其中AQP4主要分布于中枢神经系统,与脑脊液重吸收、渗透压调节、脑水肿形成等生理和病理过程密切相关[3]。我们于2007年9月至2008年7月通过给予MAPKs抑制剂U0126,研究其对实验性出血性脑损伤大鼠的脑水肿及AQP4表达的影响。1材料和方法1.1实验动物和主要试剂72只健康雄性SD大鼠(200～250g)由辽宁医学院实验动物中心提供。P-ERK1/2抗体,购自美国SantaCruz公司，AQP4抗体试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。1.2动物分组和模型制备及药物处理用随机排
4、列表法分入4组:假手术组，出血组，载体溶液对照组，载体溶液加U0126组,每组各18只。U0126用药方法称重大鼠并以0.1mg/kg体重计算U0126(1，4-二氨基-2，3-氰基-1，4-双[2-氨基苯基硫代]丁二烯)用量，将U0126溶解于DMSO中并以0.1mmol/L的PBS稀释为总量300μL。于造模前30min自尾静脉注入。相同DMSO含量的PBS溶液300μL尾静脉注射作为载体溶液对照。假手术组和脑出血组在造模前相同时间点自尾静脉注入等容量量生理盐水。采用大鼠缓慢注射自体血出血模型，依照Gieorge
5、Paxinos大鼠脑立体定位图谱[4]经立体定位仪介导将取自股动脉的自体75μ9L新鲜全血用微量注射针缓慢注入右侧尾状核。以动物出现不能完全伸展对侧前爪或向外侧划圈或向对侧倾倒作为模型成功的判断标准。假手术组，按上述方法进针，但不注血。各组均于造模后24h断头取材。1.3脑组织含水量测定各组取6只大鼠用于含水量的测定,采用干湿法,于出血侧前缘取脑组织约100mg,称取湿重,于85℃烘烤后称取干重,计算含水量:脑组织含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%。1.4伊文斯蓝含量的测定各组另取6只大鼠以其右侧半球病灶前
6、半部分用于伊文斯蓝含量的测定,采用甲酰胺浸泡法,于股静脉注入2.5%伊文斯蓝盐水液0.2mL/100g体重,断头取脑后加入10%三氯醋酸沉淀蛋白,用无水乙醇匀浆,提取伊文斯蓝,取上清液在600nm测定吸光度。绘制标准曲线测出伊文斯蓝含量(μg/g湿重)。1.5免疫组织化学各组取6只大鼠,取出血灶周围脑组织,冠切制作4μm石蜡切片,用两步法进行染色。1.6Westernblot检测各组取6只大鼠以其剩余右侧半球病灶后半部分用于蛋白印记检测。出血灶周围脑组织100mg,提取总蛋白。SDS-PAGE凝胶电泳,半干法转膜,A
7、QP4一抗(1∶500)、P-ERK1/2一抗(1∶1000)4℃孵育过夜;辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(1∶1000)37℃孵育1h。ECL光化学法显色,用Gelwork94.0图像分析系统测定吸光度。1.7统计学方法所测数据以x±s表示，以SPSS15.0统计软件，采用单因素方差分析的LSD法进行统计处理。2结果2.1脑组织含水量和伊文斯蓝含量与假手术组相比,其余各组脑组织含水量及伊文斯蓝含量明显增加,差异有统计学意义（P<0.05)。出血组含水量载体溶液对照组高于U0126组，P<0.05。出血组
8、伊文斯蓝含量载体溶液对照组高于U0126组，P<0.05,而出血组和载体溶液对照组差异无统计学意义(P<0.05，见表1）。表1脑组织含水量和伊文斯蓝含量结果2.2免疫组织化学结果9AQP4阳性染色位于星形胶质细胞、室管膜细胞和血管间隙,神经元为阴性,海马区表达强度高于皮质。出血组和载体溶液对照组及U0126组表达强度明显高于假手术
