肝硬化肝性脑病大鼠脑水通道蛋白4的表达与脑水肿的关系

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1、·英文缩略语·6中国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：日期：趔!生：少中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识

2、产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容(保密内容除外)，以采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：指导教师签名：刻盘壁乡胬砌·中文论著摘要·肝硬化肝性脑病大鼠脑水通道蛋白一4的表达与脑水肿的关系目的脑水肿(cerebraledema)是各种颅脑疾病的严重并发症，严重时可危及生命。但对其治疗主要局限于渗透性利尿或外科减压，治疗效果欠佳

3、，其原因是①脑水肿的发生机制尚不十分明确；②各种原因引起的脑水肿机制不完全相同。新近有研究显示，水通道蛋白(aquaporinAQP)是大脑水转运的一个重要分子，它可能参与多种神经系统疾病中脑水肿的形成。AQP是对水专一的通道蛋白，普遍存在于动物、植物和微生物中。它所介导的自由水快速被动的跨生物膜转运，是水进出细胞的主要途径。大脑中表达的水通道蛋白主要是AQPl、AQP4和AQP9，其中AQP4更为重要。已经有研究证明，APQ4参与了包括创伤、脑梗塞、水中毒、脑出血等疾病的脑水肿形成。最近有研究提出肝性脑病(HepaticencephalopathyHE)时存在

4、脑水肿，但对于AQP4在其中的表达和作用，是否AQP4在肝硬化肝性脑病时出现的脑水肿中起作用，目前还缺乏研究。本实验通过建立大鼠肝硬化模型，高血氨诱导肝性脑病，切取脑组织测量其脑组织含水量，并且进行AQP4免疫组织化学染色，通过图像分析系统分析各组大鼠脑组织中AQP4的表达。同时测量动脉血氨，脑组织中EB含量并且进行统计学分析和处理。从而探讨肝硬化肝性脑病脑水肿的发生的分子机制，为治疗脑水肿新方法的发现提供理论依据。研究对象与方法1、动物模型制作采用四氯化碳腹腔注射，建立大鼠肝硬化模型，并在最后一次给药后两天经盲肠给予乙酸铵。尾静脉注射伊文思蓝(Even，sbl

5、ueEB)。实验结束后，对不同组别(正常组、正常氨负荷组、肝硬化组、肝硬化氨负荷组)，分别测量动脉血氨，脑含水量及EB含量。同时，采集大鼠动物模型肝组织，多聚甲醛固定，常规HE染色，显微镜下观察肝硬化形成情况。2、动脉血氨的测定对于不同组别的大鼠，沿腹部正中线开腹后。在肾动脉下方lcm处的腹主动脉取血2ml，肝素抗凝。用干式生化法检测。3、EB含量的测定将不同量的EB放入甲酰胺中，混合为2ml的液体，浓度分别配置成分别5ug／ml，0．25lag／ml，0．1251．tg／ml，0．0625ug／ml，0．0313ug／ml，0．0156ug／m1。37℃水浴4

6、8h后，于紫外分光光度仪上(波长632nm)进行比色，蒸馏水做空白对照，制作标准曲线。然后，取脑组织称重，加入3ml甲酰胺中，37℃水浴48h。1500r／min离心10min。取上清液进行比色。结果以EB／脑重(1ag／g)表示。4、脑组织含水量测定对于不同组别的大鼠，活体经心脏快速灌注生理盐水至右房流出液变清，迅速断头取脑。用电子天平称量湿重，100。C电热恒温干燥箱内烘烤24h后，立即称取干重，计算脑组织含水量：BWC=[(湿重一干重)／湿重]X10096。5、免疫组化检测使用免疫组化S．P法，对切取固定的标本进行常规浸蜡，制作出蜡块，并且进行常规切片，组

7、织材料脱蜡及水化；应用H20：抑制内源性过氧化物酶活性，PBS洗涤切片；采用微波炉热修复进行抗原修复。滴加一抗后，4"C过夜，室温在放置1h，再滴加二抗，室温下也放置lh，滴加S-P试剂，制作盖玻片。使用MetemorphDp-10图像分析系统进行平均光密度和显色阳性面积检测。6、数据处理采用方差分析的方法，以p<0．05作为差异具有显著性的标准。实验结果1、动脉血氨测定结果2肝硬化组与正常组比较，差异具有显著性(p<0．05)：肝硬化氨负荷组与正常组比较，差异具有明显的显著性(p

8、含量差异不具有显著性(p