中药对mcao大鼠脑巢蛋白表达的影响

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1、http://www.paper.edu.cn1中药对MCAO大鼠脑巢蛋白表达的影响122周永红，王新陆，胡怀强1青岛大学医学院中医教研室（266021）2山东中医药大学（250014）摘要：目的：研究中药复方对大脑中动脉闭塞（MCAO）模型大鼠脑内巢蛋白的影响，探讨其促进神经发生的作用。方法：30只大鼠随机分为药物组、病理模型组、正常对照组3组。用Tamura法造成MCAO大鼠模型，于造模成功后6天药物组灌胃给予中药复方复健片10g/kg，余二组分别灌胃给予同等量生理盐水，日1次，共2周。用免疫组化法观察MCAO大鼠脑内巢蛋白的表达。结果：药物组大鼠脑内巢蛋白表达明显增强。结论：中药复

2、方复健片可显著增强MCAO大鼠脑内巢蛋白的表达，从而促进缺血性卒中神经发生。关键词：中药；缺血性卒中；巢蛋白复健片是我们临床治疗缺血性卒中的经验方，具有滋补肝肾作用，是纯中药制剂。临床研究表明，复健片可有效治疗缺血性卒中，改善患者的神经功能缺损评分、日常生活活动能力、智能状况和胰岛素抵抗状态，还可增加梗死周围组织及对侧的局部脑血流[1]。为探讨其作用机制是否与神经发生有关，我们进行了深入的实验研究。1实验材料1.1实验动物：普通级健康Wistar大鼠30只，12周龄，体重300±20g，雌雄不限（山东省实验动物中心提供）。单笼饲养一周，自由饮水和摄食。饲养室温度24-25℃，相对温度7%

3、左右，光照明暗比为13：11。1.2实验仪器：显微手术钻，XSZ-2型，上海光电公司；双极电凝器，SJ-2型，上海光电公司；WT11001R型电子天平，江苏省常州市万得天平仪器厂；电热恒温水槽，DK-600型，上海精宏实验设备有限公司；手术显微镜，光学显微镜均为上海医用光学仪器厂产品；大鼠固定器。1.3实验药品及试剂：巢蛋白（nestin）免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；戊巴比妥钠购自上海化学试剂采购供应站分装厂；注射用青霉素钠购自山东鲁抗医药股份有限公司；氯代三苯基四氮唑（红四氮唑，TTC）购自上海试剂三厂。2实验方法2.1动物分组：实验动物随机分为药物组、病理模型组、正

4、常对照组3组，每组10只。模型组和药物组按下述方法制作大脑中动脉闭塞（middlecerebralarteryocclusion，1基金项目：国家自然科学基金（No.30171165）1http://www.paper.edu.cnMCAO）模型，假手术组大鼠行同样开颅术，但不凝闭大脑中动脉，其余操作同模型组。[2]2.2大鼠MCAO模型的制备：按Tamura的方法稍加改进行右侧近端大脑中动脉电凝术。麻醉醒后24h内出现（1）左侧肢体痛刺激收缩现象消失；（2）向左侧倾倒或转圈；（2）提尾时左上肢不能向前伸直。具备以上3项为MCAO模型复制成功，纳入试验，进行分组，余者弃之。2.3给药方法

5、：药物组灌胃给予复健片（由山东鲁信药业有限公司生产，主要药物为何首乌、草决明、桑寄生、海马、淫羊藿等）水溶液10g/kg，余二组分别灌胃给予同等量生理盐水，日1次，共2周。于造模成功后6d给药，固体饲料和水自由摄取。2.4切片制作：实验动物结束喂药、末次观察神经系统症状后，迅速开胸暴露心脏，经升主动脉插管后，先用100ml生理盐水快速冲洗，随后用4%多聚甲醛磷酸缓冲剂心脏灌注约30min，灌毕立即取脑浸入上述固定液1d，常规脱水、浸蜡、包埋。予正中隆起水平在切片机上行4μm连续冠状切片备用。2.5巢蛋白表达：采用免疫组织化学法（ABC法）进行观察。（1）免疫组织化学染色：石蜡切片常规脱蜡

6、复水；30%H2O21份+蒸馏水10份混合，室温5～10分钟以灭活内源性酶，蒸馏水洗10min×3次；滴加复合消化液10min，蒸馏水洗3次；滴加正常山羊血清封闭液20min，不洗，甩去多余液体；滴加兔抗鼠Nestin一抗（l:2000，Sigma），室温下（25℃）孵育2小时，再4℃过夜，PBS洗2min×3次；滴加生物素化山羊抗兔IgG，室温下20min，PBS洗2min×3次；滴加试剂SABC复合物，室温20min，PBS洗5min×4次；DAB显色：使用DAB显色试剂盒。取1ml蒸馏水，加试剂盒中A、B、C试剂各1滴，混匀后加至切片。室温显色，镜下控制反应时间，一般10分钟左右。

7、蒸馏水多次洗涤；苏木素轻度复染。脱水，透明，中性树胶封片。显微镜观察。（2）免疫组织化学染色对照：用正常山羊血清和PBS代替Nestin一抗作孵育，其余步骤同上，用以检查Nestin免疫反应的特异性。2.6图像分析方法全部测量均在相同光学条件下完成。采用LeicaQwinV3图像分析系统对免疫组化切片进行图像分析，测定染色平均灰度。2.7统计学方法将所有数据输入IBMPC机，应用SPSS10.0软件包进行统计分析。组间计量资料比较采