锦红片对胆管炎大鼠胸腺的影响论文

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1、锦红片对胆管炎大鼠胸腺的影响论文.freelpus公司产品;TEM-1200透射电镜，日本日立公司产品;石腊切片机，日本Aiediatedfluorescein-dUTPnickendlabeling，TUNEL）试剂盒，BoehringerMannheim公司产品;Bcl-2单克隆抗体（兔抗鼠IgG）和Fas单克隆抗体（兔抗鼠IgG），Gene公司产品;免疫组化试剂盒，福州迈新生物技术公司产品;蛋白酶K、DNA酶和二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB），Sigma公司产品。1.2实验方法动物领来后放入实验场所3d以适应环境，造模前禁食

2、8h，禁水4h。参照龚建平等［6］的造模方法，将实验大鼠胆总管结扎，同时向胆总管内注入致病性大肠杆菌，建立大鼠急性胆道感染模型。1.3实验分组24只SD大鼠随机分为3组，每组8只。胆总管单纯结扎组（简称单纯结扎组）:结扎胆总管，但不注射细菌，手术后喂以生理盐水。模型组:造模手术后喂以生理盐水。锦红片治疗组:造模手术后喂锦红片悬液，由上海中药制药一厂提供锦红片干粉，以蒸馏水配成含干粉110mg/ml的悬混液，按10ml/kg体质量灌胃，2次/d。于手术后第5天处死大鼠，胸腺取材。1.4检测指标1.4.1胸腺质量和胸腺指数完整取出胸腺后，电子天平称取胸腺质量

3、，计算胸腺指数。胸腺指数=胸腺质量（mg）/体质量（g）1.4.2光镜观察胸腺组织以中性福尔马林固定，常规脱水，包埋，切片，脱腊至水，HE染色。1.4.3电镜观察取约1mm×2mm的胸腺组织，用2.5%戊二醛固定，梯度脱水，包埋，超薄切片，醋酸铅染色，透射电镜下观察。1.4.4Bcl-2基因编码蛋白免疫组化2μm石腊切片，脱腊至水，3%H2O2室温孵育5～10min，以消除内源性过氧化物酶的活性，蒸馏水冲洗，用微波热修复抗原，PBS浸泡5min，5%～10%正常山羊血清封闭，室温孵育10min;倾去血清，滴加1∶200Bcl-2单抗100μl，37℃孵育

4、60min或4℃过夜;PBS冲洗3次，5min/次;滴加适当比例的生物素标记二抗100μl，37℃孵育10～30min;PBS冲洗3次，5min/次;滴加适当比例稀释的抗生物素辣根过氧化物酶标记链霉卵白素，37℃孵育10～30min;PBS冲洗3次，5min/次，加DAB显色;自来水充分冲洗，复染，封片。同时设立阴性对照，以正常兔血清代替一抗。1.4.5Fas基因编码蛋白免疫组化步骤基本同上，Fas单抗工作浓度为1∶150。1.4.6TUNEL检测按原位细胞凋亡检测试剂盒说明操作，即以生物素化脱氧三磷酸尿苷（deoxy-uridinetriphospha

5、te，dUTP）标记DNA片段钝端，再用免疫组化法放大标记信号，用DAB显色，苏木素衬染。1.4.7切片分析对TUNEL检测、Bcl-2及Fas表达分析，在不告知动物分组信息的前提下，分别送复旦大学医学院和上海交通大学医学院作阅读分析并出具报告。1.5统计学方法胸腺质量、胸腺指数、凋亡指数等用x±s表示，数据用SPSS10.0统计软件进行方差分析。免疫组化数据用χ2检验。2结果2.1各组胸腺质量和胸腺指数模型组胸腺质量和胸腺指数均降低，而锦红片治疗组均升高。见表1。2.2TUNEL检测高倍镜下随机计算各组每份标本上、下、左、中、右5个视野的凋亡指数。凋亡

6、指数（%）=（阳性细胞数/细胞总数）×100。经TUNEL标记后，光镜下凋亡细胞的核呈深棕色，标记阳性细胞着色多位于细胞核周边，核中央反应不明显，细胞结构仍较完好。见表2、图1。表1各组胸腺质量和胸腺指数（略）Table1Theusinthreegroups*P0.05，**P0.01，vsuntreatedgroup.表2各组胸腺凋亡指数（略）Table2Theindexofapoptosisofthymusinthreegroups*P0.05，**P0.01，vsuntreatedgroup.2.3Bcl-2和Fas表达分析Bcl-2阳性细胞着色多

7、位于胞浆及胞膜。锦红片治疗组胸腺Bcl-2基因编码蛋白表达与模型组相比，差异有统计学意义（P0.01）。Fas阳性细胞着色多位于胞浆、胞膜，部分位于胞膜外。根据细胞有无着色、着色深浅及着色细胞的比例拟定半定量评分。A项按显色有无及显色深浅计分:0分为不着色，1分为浅黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色;B项按显色细胞的比例评分:1分为1%～10%，2分为11%～30%，3分为31%～50%，4分为51%以上。每例总积分=A×B，总积分0分为（），1～3分为（+），3～6分为（++），6分以上为（+++）。各组Bcl-2和Fas表达均检测8份标本，每张切片高倍

8、镜下随机取上、下、左、中、右5个视野计数。结果见表3。2.4光镜观察模型组胸腺皮