陈华伟-蛋白样品制备、定量及wb

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1、蛋白样品制备、定量及WesternblotBrandDep.陈华伟www.sangon.com2主要内容蛋白样本制备123645蛋白提取产品选择指南蛋白定量方法的选择成功WesternBlot的实验方案WesternBlot简介与流程案例分析—细胞总蛋白的提取蛋白样本制备---成功蛋白分析的基础www.sangon.com3制备原则方法应具备标准化，具有重现性、可靠性、简便性尽量抽提完全应使所有蛋白全部处于溶解状态防止发生蛋白的降解、聚集、沉淀、变性防止在抽提过程中发生化学修饰尽量去除起干扰作用的高丰度

2、蛋白或无关蛋白必要时去除样品中的核酸和某些干扰蛋白蛋白样本制备的策略目的蛋白的结性质与分布分布于胞桨/胞核/膜可溶/不可溶含量多少分子量大小四级结构特征磷酸化修饰…实验材料细胞组织固定组织或石蜡包埋组织微生物酵母植物提取RNA后的剩余的蛋白样本等制备蛋白的目的活性分析免疫印迹杂交免疫沉淀或共沉淀双向电泳…方法的选择1自行配制抽提试剂,根据文献方法或经验提取2购买商品化试剂盒,按其说明书的方法提取www.sangon.com4案例分析--细胞中总蛋白的制备www.sangon.com5高速离心收集上清即得

3、全蛋白样本细胞加入裂解液冰上放置10-15分钟蛋白定量和SDS-PAGE检测裂解样品离心收集定量检测细胞裂解液-RIPABuffer的配方分析及技术要点www.sangon.com表面活性剂缓冲液蛋白酶抑制剂磷酸酶抑制剂其它：H2O、NaCl、等还原剂RIPABuffer溶解膜与脂膜，溶解与稳定蛋白质。Tris-HCl（pH7.5)，提供pH环境，使蛋白保持稳定，增加溶解性。防止蛋白质发生氧化，保护二硫键。DTT、β－巯基乙醇等。抑制磷酸酶的活化，防止蛋白样本脱磷酸化，使用前临时加入。抑制蛋白酶活性，防

4、止蛋白被水解，使用前临时加入。全蛋白抽提时注意事项www.sangon.com7可以适量加入甘油,稳定蛋白注意事项可以适量加入核酸酶,去除DNA,充分提取蛋白,降低提取的粘度抑制蛋白酶及磷酸酶使用的表面活性剂的种类、纯度、浓度、干扰、去除等因素试剂和器皿冰上预冷,低温4℃操作细胞或组织的样本量裂解液的用量蛋白提取产品选择指南www.sangon.com8蛋白提取变性蛋白提取活性蛋白提取细胞结构蛋白亚细胞结构蛋白提取试剂盒(BSP073)蛋白质分部提取试剂盒(BSP075)膜蛋白和胞质蛋白提取试剂盒(BS

5、P002)胞质和线粒体蛋白质提取试剂盒(BSP051)细胞核蛋白质提取试剂盒(BSP009)膜蛋白提取试剂盒(BSP049)膜蛋白，核蛋白和胞质蛋白抽提试剂盒(BSP005)细胞核蛋白/浆蛋白抽提试剂盒(BSP001)一步法酵母活性蛋白提取试剂盒(BSP026)一步法细菌活性蛋白提取试剂盒(BSP023)一步法昆虫细胞活性蛋白提取试剂盒(BSP020)一步法动物细胞活性蛋白提取试剂盒(BSP022)一步法动物组织活性蛋白提取试剂盒(BSP006)一步法植物活性蛋白质提取试剂盒(BSP004)石蜡包埋组织

6、蛋白提取试剂盒(BSP058)细菌细胞蛋白裂解液(PL003)酵母蛋白提取试剂盒(BSP013)动物细胞蛋白裂解液(PL001)植物蛋白提取试剂盒(BSP053)植物组织蛋白裂解液(PL028)细菌包涵体蛋白提取试剂盒(BS686)其它酵母动物动物细胞昆虫酵母植物动物组织动物全蛋白蛋白提取试剂盒RIPA裂解液、Western及IP裂解液细菌细菌活性化蛋白制备裂解液（PL020）采用特殊的酶体系及温和的去污剂，样品快速充分破裂，释放蛋白质。内含强性蛋白酶抑制剂，保证蛋白完整和最大限度保持体内蛋白的活性。适

7、用广泛：天然总蛋白、重组可溶性蛋白www.sangon.com9时间短：整个实验过程只需要10-30分钟左右。提取的蛋白质可以透析去除离子和去污试剂，或将缓冲液替换为所需要的目的蛋白质的合适缓冲液。提取的活性蛋白质保持非变性状态，可以直接用于于1D，2D电泳，免役共沉淀，Pulldown,EMSA免疫沉淀，蛋白纯化，酶活分析等实验。一步法活性蛋白提取试剂盒产品特点：蛋白提取产品选择指南www.sangon.com10抑制剂蛋白酶抑制剂复合物磷酸化酶抑制剂混合物I、II、III(PLO17/8/9)动物细

8、胞(PL009)真菌和酵母(PLO26)细菌(PL027)样品制备血清蛋白清除剂(BSP065)通用型蛋白沉淀剂(BSP012)兰色琼脂糖重力柱(BSP089)重力型去盐柱(BSP090)柱式血清白蛋白、免疫球蛋白清除液(BSP064)蛋白检测产品选择指南www.sangon.com11蛋白检测和分析无毒型蛋白质胶快速染色试剂盒(SK3011)高灵敏快速考马斯亮蓝染色试剂盒(BSP041)快速银染试剂盒(BSP029S-N)糖蛋白凝胶染色试