westernblot蛋白提取与样品制备

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1、WesternBlot蛋白提取与样品制备 >>>>    WesternBlot第一步便是样品制备，但是在开始制备样品之前，实验者应该对自己的实验有一个非常清晰的思路，通常需要思考的最基本问题包括：要检测的靶蛋白是否存在该样品中？靶蛋白的含量是否在WesternBlot的检测下限以上（目前认为WesternBlot的有效检测下限为0.1-1ng)？要检测的靶蛋白在组织或细胞的哪个时期存在？是否需要特殊刺激才会表达？是否只有在病变组织中才会有表达？是否存在多种异构体？是否容易发生自行降解？靶蛋白分子量是不是非常大或者非常小？靶蛋白是否仅存在特殊的细胞器中而需

2、要分离出细胞器？充分思考了这些问题才有可能对样品制备有一个比较完善的策略。    蛋白提取可以分为三个步骤：第一步获取材料，第二步分离目的细胞或组织成份并破碎，第三步就是进行裂解制样。这里就这三个步骤展开一一讨论。    材料的获取   从大方向讲，WesternBlot的对象可以是植物组织、动物组织和培养物。植物组织的获取一般应该不是很困难，尤其是可进行人工种植的植物更是方便。动物组织的获取就相对困难许多，一是要考虑到法律上的问题，二是需要实验者有丰富的解剖经验，可以快速准确地从动物体上取下需要的组织或Organ(要和谐，下同)。培养物就不用多说了，几乎

3、每个实验者都养过细菌或者细胞的。如果是动物组织或者植物组织，一般情况下都可以用手术刀和手术剪从个体上分下需要的部份。如果是细菌，则可以将养好的菌液收集起来离心，然后弃去上清即可，如有必要，可以再用等渗中性溶液洗涤数次。如果材料是培养的细胞，建议将细胞从培养瓶（皿、板）内刮下来再离心处理，也可以不收集采取而直接在培养容器中裂解，详见下文。非常不建议用酶将细胞从培养器皿上消化下来再进行裂解。在组织或者细胞进行裂解之前，一般都要将组织或者细胞清洗干净（对于组织可用预冷的等渗buffer洗涤，对于细胞也用等渗buffer洗涤再用离心法去掉洗涤液即可），以除去组织中

4、的污垢、血液和细胞培养中的培养基以及添加物。    细胞破碎  如果收集到的材料是组织或者Organ，第一步往往是将它们分切成小块方便操作。接下来就是准备进行细胞破碎了。细胞破碎的方法分为机械法和非机械法，机械法可以是振动、搅拌、研磨、压滤、超声、匀浆，非机械法可以是干燥、改变渗透压、冻融、酶解（纤维素酶、溶菌菌、蜗牛酶）等，不同来源的材料对于不同的处理方法耐受程度是不一样的，例如超声波可以很容易破碎动物细胞，但是破碎酵母细胞就困难许多。在这里有三个问题需要指出：（1）所有的操作尽量在低温条件下进行，防止细胞内的蛋白酶释放出来而将目的蛋白降解，最好全程都在

5、冰浴中进行，有条件用液氮的就用液氮，下同。（2）超声处理中会释放出大量的热，因此一定需要冰浴。同时超声过程会释放自由基，有可能改变蛋白质的结构，可向系统中加入少量的GSH（谷胱甘肽）进行还原。另外，超声过程有可能打断蛋白质大分子，所以如果研究的蛋白质分子量比较大时建议减少超声处理时间或者换用其它方法处理。（3）如果使用蛋白酶处理，可能会将目的蛋白降解，同时还引入了新的蛋白质从而干扰实验，所以一般不推荐使用。细胞的破碎与裂解过程没有严格的时间和空间界线，其作用仅仅是为了使裂解过程更容易，因此在破碎细胞过程中所用的Buffer一般也是裂解时的裂解液，注意不能加

6、太多，根据经验，一般每克组织加2-3ml裂解液为宜。    杂质的去除  除了前面获取材料时提到的组织中的污垢、血液和细胞培养中的培养基以及添加物这些杂质外，附在组织上的油脂、细胞外层的细胞壁、细胞内部的长链DNA等都会干扰WesternBlot中的SDS-PAGE一步，因此有必须除去。对于油脂，一般可以直接离心除去（一般以10000g离心10min油脂都会漂浮在最上层，吸走即可），也可以利用SiO2将其吸附而离心除去（10000g，10min，油脂在下层）。对于细胞壁，一般在裂解液中的溶解比较差，待裂解完直接离心除去即可。对于长链DNA，可用链霉素使之沉

7、淀再离心除去，也可以用超声波处理将其打断变成小片段DNA，就不会干扰SDS-PAGE而不用从体系中除掉。    蛋白质的提取   蛋白质的提取过程，简言之就是使细胞内的靶蛋白尽可能都溶解于液相而方便进行电泳，其核心思想就是根据靶蛋白的特性，选择合适的助溶剂和保护剂。这一部份涉及到的内容比较多，我就一步一步地讨论。    （1）蛋白质的分类蛋白质的分类方法比较多，可以按照功能分类、可以按照在细胞中的定位分类、可以按照溶解性分类、可以按照三维结构分类。这里只提按溶解性和在细胞中的定位分类法，这两种分类对理解蛋白质的提取极有帮助。按照溶解特性分类，蛋白质的分类情

8、况如下：（参阅王镜岩版生物化学）种类举　　例溶解特性清蛋白血清白蛋