蛋白质样品的制备(I)

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1、第二章蛋白质样品的制备蛋白质样品的制备是蛋白质组研究的第一步，无论后续采用怎样的分离或鉴定手段，样品制备都是关键步骤。从蛋白质组大规模研究的角度而言，要求样品制备尽可能获得所有的蛋白质，但是由于蛋白质种类多、丰度不一和物化特性多样等，要达到真正的全息制备是具有难度的。“在制备中丢失的蛋白是永远不可能在后面的试验中弥补回来的”样品制备的原则尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白丢失。细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解，低温和蛋白酶抑制剂以防止蛋白的降解。样品裂解液应该新鲜配置，并且分装冻存于-80℃。勿反复

2、冻融已制备好的样品。通过超速离心清除所有的杂质。加入尿素后加温不要超过37℃，防止氨甲酰化而修饰蛋白。一、样品的类型1.整体样品是生物个体小的物种（如微生物），可以整体取样。2.组织样品有一个采样的过程，就是从整体部分或整批器官中抽取一定量具有代表性的样品进行实验。3.细胞样品包括固体基质中培养的细胞、体外悬浮培养生长的细胞、周期性细胞样品（如红细胞、淋巴细胞）和从组织中分离同类的细胞样品。4.可溶性样品是可溶性液体样品，如血清、血浆、尿样、脑脊液以及细胞和组织的水溶性提取物。第一节样品破碎与分离蛋白质二、组织与细胞

3、破碎为了完全分析所有的细胞内蛋白，组织与细胞必须进行有效的破碎。破碎方法的选择依赖于样品来源（如细胞、固体组织或者其它的生物材料），同时也依赖于这种分析是获得所有的蛋白质还是特殊的亚细胞器组分。蛋白酶在细胞破碎时很可能释放出来，其会导致某些蛋白质降解而使双向电泳图谱的分析复杂化，因此蛋白质样品应该利用蛋白酶抑制剂加以保护。（一）温和的裂解方法通常应用于组分比较简单的样品，例如组织培养的细胞、血细胞和一些微生物，或者用于分析某一特定的细胞器，例如只需要裂解胞质蛋白、完整的线粒体或其它的细胞器。有时这些技术联合起来应用。

4、1.渗透裂解非常温和的裂解方法，可进一步进行亚细胞分级应用对象：血细胞、组织培养细胞。操作步骤：将细胞悬浮于渗透胞溶液中，细胞溶胀而释放出细胞内容物。2.冻融裂解许多类型的细胞可以通过快速反复冻融得到裂解应用对象：细菌细胞、组织培养细胞。操作步骤：使用液氮，快速反复冻融至符合实验要求为止。3.裂解液裂解含有去污剂的裂解液处理细胞、组织以裂解细胞膜，使细胞内容物释放出来。应用对象：组织培养细胞操作步骤：将细胞直接置裂解液或样品液中，进行悬浮处理。4.酶裂解有细胞壁的细胞可以通过酶解去除细胞壁得以温和裂解。应用对象：植物

5、细胞、细菌细胞、真菌细胞。操作步骤：将细胞悬浮于专一性酶的等渗溶液中。二、剧烈的蛋白裂解常用于难于破碎的细胞，如固体组织内的细胞，或具有坚硬细胞壁的细胞，如酵母细胞，这种方法可以使细胞完全破碎裂解。1.超声裂解法超声仪可以产生超声波，通过切应力来裂解细胞。在剧烈搅拌的状态下会产生剪切效果。应用对象：悬浮细胞操作步骤：要进行间歇处理，减轻产生热和泡沫，样品处理应在冰浴中进行。2.压力杯法在高压下迫使细胞穿过小孔径而产生剪切力，从而裂解细胞。应用对象：微生物细胞，如细菌、霉菌、酵母细胞及含有细胞壁的细胞。操作步骤：将细胞

6、悬浮液置于预冷的压力杯中，施加压力，然后收集挤出液。3.研磨法用研钵或研杵研磨细胞应用对象：固体组织细胞、微生物细胞。操作步骤：组织或细胞通常冻存于液氮中，随后研磨成粉状，加氧化铝或砂有助于研磨。4.机械匀浆法使用匀浆器破碎细胞或组织应用对象：固体组织，如心脏、肝脏、肾脏组织和细胞悬液。操作步骤：先尽量将组织剪成块，然后加有蛋白酶抑制剂的冷匀浆液进行匀浆，过滤或离心收集。5.玻璃珠匀浆法剧烈震荡的玻璃珠打破细胞壁，释放细胞内容物应用对象：细胞悬液或微生物操作步骤：用等体积的预冷裂解液重悬细胞，置于结实的管子里。每克细

7、胞（湿重）加入1-3克玻璃珠，剧烈震荡1min，冰浴1min。重复上述步骤。三、用蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解当进行细胞裂解时，蛋白酶会释放出来，这会严重影响电泳的结果，因此需要采取一些策略。如果可能的话，直接加入强变性剂。蛋白酶在低温下无活性，因此尽可能在低温下进行样品制备。另外，许多组织蛋白酶在PH超过9.0的时候会失活，因此在样品裂解液中出现Tris、碳酸钠和载体两性电解质时也可以抑制蛋白降解。虽然这些方法可防止蛋白降解，但是有些蛋白酶在上述条件下仍然保持降解蛋白的活性。此时，需要应用蛋白酶抑制剂。⑴PMSF(苯甲

8、基磺酰氟）是一种不可逆抑制剂，通常浓度为1mmol/L,灭活丝氨酸蛋白酶和一些半胱氨酸蛋白酶，但是其局限在于在水溶液中迅速失活，因此，现用现加效果较好；另外，在二硫苏糖醇（DTT）或者β-巯基乙醇溶液中PMSF的抑制效果可能会减小，因此在含巯基的试剂中可在晚些时候加入。⑵AEBSF为不可逆抑制剂，通常工作浓度为4mmol/L，作用与PMSF相似