双向电泳蛋白样品的制备

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1、双向电泳样本制备辉骏生物：http://www.fitgene.com/免费服务热线：400-699-1663一、蛋白质提取原则：二、样本裂解方式：三、2D蛋白裂解液组成及作用：1：裂解液组成及作用2：常见裂解液四、蛋白质提取步骤：五、蛋白质样本制备实例：1：动物组织样本制备2：植物组织样本制备六、样本制备试剂：双向电泳样品制备：辉骏生物：http://www.fitgene.com/免费服务热线：400-699-16631:蛋白质制备主要目的：(1)：细胞，组织的破碎裂解(2)：蛋白质溶解以及破坏蛋白质与蛋白质分子之间，蛋白质与非蛋白质之间的共价与非共价相互作用2:蛋白质制

2、备主要遵循的原则：(1)：尽可能溶解全部蛋白质，打断蛋白质之间的共价结合，使蛋白质以分离的多肽形式存在。(2)：避免蛋白质的修饰作用与蛋白质的降解作用。(3)：避免脂类、核酸、盐等物质的干扰作用。(4):去除高丰度蛋白对低分度蛋白的掩盖作用。(5):防止样品在聚焦时发生蛋白质的聚集和沉淀。(6)：蛋白质样品与第一向电泳的相容性。一、双向电泳样本制备原则辉骏生物：http://www.fitgene.com/免费服务热线：400-699-1663破碎的方法适用材料原理渗透裂解血细胞组织培养细胞将细胞悬浮在低渗透液中裂解细胞。冻融裂解细菌细胞组织培养细胞利用液氮将细胞迅速冻结后再

3、融化。如果需要，可反复进行。去垢剂裂解组织培养细胞去污剂能溶解细胞的细胞膜从而破坏细胞。注：如果使用了诸如SDS这样的离子型去污剂，为了确保不干扰IEF，可将裂解的样品在含有过量的非离子或兼性去污剂的溶液中稀释或利用沉淀法,除去SDS。酶裂解植物组织细菌细胞真菌细胞在等渗透液溶液中用酶处理细胞。如溶菌酶用于细菌细胞；纤维素酶和果胶酶用于植物细胞）。二、双向电泳样本裂解方式——温和裂解方式破碎方法适用材料原理超声波法：细胞悬浮液通过超声波发生器产生的超声波剪切力将细胞破碎，但必须注意减少热量的产生和泡沫的形成。高压法：带细胞壁的微生物在高压情况下通过小孔对细胞施加压力产生的剪切

4、力破碎细胞研磨法：固体组织微生物利用研杵手工将它们破碎机械匀桨法：固体组织可用手动匀浆器或电动匀浆器能来破碎细胞悬浮液或较柔软的组织。滚珠粉碎法：细胞悬浮液微生物旋转玻璃球的摩擦作用能破坏细胞壁，并释放细胞的内含物。二、双向电泳样本裂解方式——剧烈裂解方式辉骏生物：http://www.fitgene.com/免费服务热线：400-699-1663组成种类作用变性剂脲、硫脲、两者的混合物破坏氢键等次级键，使肽链链伸展，暴露疏水中心去垢剂非离子去垢剂、两性离子去垢剂、阴离子去垢剂破坏蛋白质分子间的疏水相互作用。还原剂β-巯基乙醇，二硫苏糖醇（DTT）,TBP断裂蛋白质中的二硫键

5、，以利于肽链的分离蛋白酶抑制剂PMSF,AEBSF,EDTA,多肽蛋白酶抑制剂，磷酸酶酶抑制剂抑制蛋白酶活性三、双向电泳样本制备裂解液组成及作用辉骏生物：http://www.fitgene.com/免费服务热线：400-699-16631、变性剂：(1)作用：改变或破坏氢键等次级键的结构，使蛋白质的肽链伸展开来，充分暴露疏水中心。(2)分类：脲，硫脲，或两者的混合物可以增加蛋白质的溶解性，特别是膜蛋白。必须避免将含有尿素的溶液加热到30度以上，因为这样会使其水解为氰酸盐，修饰蛋白质，改变蛋白质的电荷。三、双向电泳样本制备裂解液组成及作用辉骏生物：http://www.fit

6、gene.com/免费服务热线：400-699-16632、去垢剂：(1)作用：破坏蛋白质分子间的疏水相互作用。(2)种类：a:非离子去垢剂：tritonX-100,NP-40b:两性离子去垢剂：CHAPS,CHAPSOSB3-10(不溶于浓度高于5mol/L的脲中）ASB(具有比CHAPS更强的膜蛋白溶解力）c:阴离子去垢剂：SDS（小于0.25%，同时确保其他去垢剂与SDS的比例至少为8：1）三、双向电泳样本制备裂解液组成及作用辉骏生物：http://www.fitgene.com/免费服务热线：400-699-16633、还原剂：(1)作用：断裂蛋白质中的二硫键，以利于

7、肽链的分离。(2)分类:β-巯基乙醇，二硫苏糖醇（DTT）,二硫赤藓糖（DTE）a:其中DTT带有电荷，在等点聚焦时，常常会迁移到PH范围以外，从而使某些蛋白质的二硫键重新配对，使溶解度降低而重新沉淀下来。使用浓度范围10~100mmol/L.b:采用非离子还原剂三丁基膦TBP可以大大增加蛋白质的溶解性，并利于蛋白从第一向转移到第二向。但是TBP在水溶液中的不稳定性和不溶性，使其在第一向IEF中维持蛋白质还原状态是相对无效的。因此在IEF时建议最好使用巯基还原剂。三、双向电泳样本制备裂解液组成及作用辉骏