双向电泳的样品制备ppt课件.ppt

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1、双向电泳的技术流程和样品制备生物学问题的提出实验模型的设计实验组和对照组样品的制备蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离图像扫描和初步分析感兴趣蛋白点的切取胰酶对脱色后蛋白质的消化质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱结果的生物信息学分析和比对新蛋白质的发现其它实验的进一步验证蛋白信息的初步获得蛋白质组研究的基本技术路线蛋白质样品的制备双向电泳图像分析转印至膜上的蛋白凝胶中的蛋白溶液中的蛋白混合肽蛋白质质量N端测序肽序列质谱数据肽指纹图数据搜索新的或已知蛋白蛋白转录后修饰的鉴定染色第一向IEF电泳第二向SDS-PAGE电泳图像采集和分析蛋白斑点的切取样品制备Proteomic

2、sExperimentalWorkflow蛋白质组学核心鉴定技术1、图像分析技术2、与质谱相关的技术：pHMW质谱技术进行蛋白质鉴定的基本流程样品制备与IPG胶条水化IPG电泳与上样缓冲液浸润SDS-PAGE转PVDF膜胶内直接染色染色取出蛋白点胰酶等消化冷冻干燥MALDI-MS肽指纹图数据库查询蛋白质鉴定已知反向HPLC分离MALDI-MS，PSD片段分析未知ESI-MS-MS、微测序实验方法完整蛋白质肽混合物质谱测定肽质量（MALDI-MS,ESI-MS)选择肽段裂解(PSD-MALDI-MS,ESI-MS/MS)计算方法蛋白质序列数据库（＋核酸序列翻译数据库）

3、肽质量检索未解析碎片离子检索酶切质谱鉴定蛋白质的策略第一部分样品制备蛋白定量应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。实验样品的制备原则变性剂通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。常用尿素和CHAPS联合，但所得的样品容易吸附在IPG胶条的基质中而丢失。硫脲的

4、作用更强，但溶解度相对较差，常用2M硫脲＋5~7M尿素混合使用。增加样品溶解性的手段样品制备样品制备中使用的主要试剂及主要作用变性剂和表面活性剂是用来变性蛋白、暴露和溶解其疏水区域的。为了让大多数蛋白完全展开，还有必要来还原二硫键。常用的还原剂有具游离巯基的β－巯基乙醇（β－ME）和二硫苏糖醇（DTT）。但DTT是带电荷的物质（尤其在碱性条件下），在IEF时则迁移出pH梯度，导致一些蛋白（通常是易于通过二硫键在内部起作用的蛋白）的溶解性丢失。如果用不带电荷的三丁基膦（TBP）来代替DTT则效果更好，不但能增加蛋白的溶解性，而且有助于样品在2-DE过程中从第一相转移到

5、第二相；另外TBP不带巯基，不需被烷基化，从而简化了IPG的平衡过程。还原剂即便在变性剂和去垢剂存在的情况下，某些蛋白质也需要在盐离子的作用下才能保持其处于溶解状态，否则这些蛋白质在其处于PI点时会发生沉淀。两性电解质的作用在于捕获样品中的少量盐分，从而保证蛋白质的溶解性。应用时，两性电解质的浓度应小于0.2％（w/v)。浓度过高会使IEF的速度降低。另外，为了保证实验的精确性，在选择不同pH范围的IPG胶条时，也应使两性电解质的pH值与之相符合。起载体作用的两性电解质经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后，还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。常用的表面活性剂有

6、离子去污剂SDS、非离子去污剂TritonX-100和NP-40、两性离子去污剂CHAPS、OBG等。SDS作用后不利于稳定IEF中的等电点，不宜存在于IEF的样品溶解液中；只有后两类表面活性剂是可用的，其中CHAPS和SB3-10最好。常用浓度为在8M尿素溶液中含2-5%的CHAPS，但在含高浓度硫脲的溶液中其作用有限；SB3-10是一种含有长线性基团尾端的两性去污剂，其作用要强于CHAPS，但在尿素浓度大于5M时不溶解。现在总结的两种IEF溶解液的配方是①5M尿素＋2M硫脲＋2%CHAPS＋2%SB3-10，适用于需要强烈表面活性剂的蛋白样品的溶解；和②7M尿素

7、＋2M硫脲＋4%CHAPS，适用于需要高浓度变性剂的蛋白质样品的溶解。表面活性剂样品制备特殊样品的制备低丰度蛋白的分离：尽管增加上样量和提高总蛋白的溶解度能增加分离时的低丰度蛋白的量，但同时增加了高丰度蛋白的负荷，且造成蛋白的叠加效应而影响分离。现常用预分级＋窄pH胶的微制备技术进行分离：即将总蛋白组分成蛋白质组亚群，再用pH梯度小于2个pH单位的IPG胶进行窄pH范围的分离。高不溶性蛋白的分离：主要还是要增加蛋白质的溶解度，采用顺序抽提法进行。特殊样品的制备主要是应用超速离心技术和顺序抽提法将总蛋白质组分成不同的蛋白质组亚群，再用适当的蛋白溶解液溶解，以降低样