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1、蛋白样本制备蛋白样本制备与与WesternBlot主要内容主要内容一蛋白样本制备的目的与重要性二蛋白样本制备的总体策略和原则三案例分析—细胞总蛋白的提取1细胞裂解液配方分析与技术要点2表面活性剂的选择3蛋白酶抑制剂与其”鸡尾酒”4磷酸酶抑制剂四蛋白提取产品选择指南1核蛋白与转录因子EMSA分析2膜蛋白提取3多种蛋白的分级提取五蛋白定量方法的选择六成功的WesternBlot1WB原理与方法2WB的成功要素3常见问题分析与解决方法一一蛋白样本制备蛋白样本制备------成功蛋白分析的基础成功蛋白分析的基础1蛋白样本制备的
2、目的:后续应用于:¢activityassays¢proteinmicroarrays¢SDS-PAGE/IEF¢immunoblotting(WesternBlotting)¢ELISA¢EMSA(gelshift)¢two-dimensionalgelelectrophoresis(2D),¢massspectrometry2蛋白样本制备的重要性:蛋白样本制备是蛋白试验的第一步,更是最重要的步骤!是决定试验成败的关键!但却往往是最容易被忽视的步骤!误解1:认为简单误解2:方法单一细胞内蛋白质的复杂性细胞内蛋白质的复
3、杂性¢种类多:数千种,并且是混合物(与核酸多糖脂质小分子混一起)¢分子大小分布范围宽:几百个至上万氨基酸,多数为1万--15万道尔顿¢含量不均:某种可能占总蛋白的10%,有些只占0.001%以下¢性质多样:正电或负电荷极性或非极性亲水或疏水,二级结构或空间结构形成大小形状残基分布等均不同的分子二二蛋白样本制备的原则蛋白样本制备的原则¢方法应具备标准化方法应具备标准化具有重现性具有重现性可靠性和简便性可靠性和简便性¢尽尽量抽提完全量抽提完全¢应使所有蛋白全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋应使所有蛋白全部处于溶解状态（
4、包括多数疏水性蛋白）白）¢防止发生蛋白的降解防止发生蛋白的降解聚集聚集沉淀沉淀变性变性¢防止在抽提过程中发生化学修饰（如酶性或化学性降防止在抽提过程中发生化学修饰（如酶性或化学性降解等）解等）¢如做如做2D2D则需去除高丰度蛋白则需去除高丰度蛋白或无关蛋白或无关蛋白¢必要时去除样品中的核酸和某些干扰蛋白必要时去除样品中的核酸和某些干扰蛋白二二蛋白样本制备的策略蛋白样本制备的策略¢制备蛋白的目的活性分析免疫印迹杂交(WESTERNBLOTTING)免疫沉淀或共沉淀(IP或CO-IP)1D2DEMSACHIP等¢实验材料细
5、胞组织固定组织或石蜡包埋组织微生物酵母植物提取RNA后的剩余的蛋白样本等¢目的蛋白的结构性质与分布分布于胞桨/胞核/膜可溶/不可溶含量多少分子量大小四级结构特征磷酸化等修饰……¢方法的选择1自行配制抽提试剂,根据文献方法或经验提取(案例分析与技术要点)2购买商品化试剂盒,按其说明书的方法提取(产品选择指南)三三案例分析案例分析----细胞中总蛋白的制备细胞中总蛋白的制备¢细胞加入细胞加入裂解液裂解液轻摇轻摇1515--3030分钟分钟¢离心收集上清即得全蛋白样本离心收集上清即得全蛋白样本¢蛋白定量和蛋白定量和SDSSD
6、S--PAGEPAGE检测检测细节决定成败!11细胞裂解液细胞裂解液--RIPABufferRIPABuffer的配方分析和技术要点的配方分析和技术要点22表面活性剂分类及作用原理表面活性剂分类及作用原理结构:两性分子,亲水的头和疏水的长尾作用:溶解膜与膜脂溶解与稳定蛋白质(特别是膜蛋白)作为蛋白质的变性剂作用原理:1去垢剂单体分配入膜扰乱膜结构,造成膜裂解,引起通透性增加,细胞内容物释放.2去垢剂分别与膜的磷脂和蛋白质结合形成胶团,脂质和膜蛋白溶解.各类表面活性剂特点各类表面活性剂特点1阴离子型:SDS脱氧胆酸盐2阳
7、离子型:CPB和CTAB3双性离子型:CHAPSZwittergent系列4非离子型:Brij系列Triton-100NonidetP40Tween系列等表表面面活活性性剂剂选选择择指指南南选用表面活性剂考虑的因素选用表面活性剂考虑的因素¢参考文献报告保持生物活性时使用的表面活性剂¢工作条件下表面活性剂的溶解性¢考虑表面活性剂的去除方法¢保护蛋白活性时,不仅考虑使用表面活性剂的种类还有浓度¢根据样本下游的应用来选择表面活性剂的种类¢表面活性剂的纯度影响提取蛋白的质量¢使用分子生物学级的表面活性剂,无核酸酶蛋白酶等¢尽量
8、使用毒性较低的表面活性剂¢因不明原因某些蛋白适用专门的表面活性剂进行分离¢有时比较难仅一种表面活性剂既能溶解蛋白又适用于蛋白分析,常先用一种表面活性剂将蛋白溶解,而另一种表面活性剂取代进行蛋白的后续分析¢某些情况下可以使用非表面活性剂NDSB结合表面活性剂来增加膜蛋白溶解性去除未结合的表面活性剂根椐表面活性剂的疏水性,CMC,凝聚
