蛋白样本制备与 western blot课件

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1、蛋白样本制备与WesternBlothttp://www.keygentec.com.cn主要内容蛋白样本制备的目的1蛋白样本制备总体原则和策略2案例分析—细胞总蛋白的提取3成功的WesternBlot6蛋白提取产品选择指南4蛋白定量方法的选择5CompanyLogo一蛋白样本制备---成功蛋白分析的基础蛋白样本activityassaysproteinmicroarraysSDS-PAGE/IEFimmunoblottingmassspectrometry2-DEEMSAELISA蛋白样本制备的目的:后续应用CompanyL

2、ogo二蛋白样本制备的原则蛋白样本制备原则方法应具备标准化，具有重现性、可靠性、简便性；尽量抽提完全；应使所有蛋白全部处于溶解状态防止发生蛋白的降解、聚集、沉淀、变性防止在抽提过程中发生化学修饰如做2D则需去除高丰度蛋白或无关蛋白必要时去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。CompanyLogo二蛋白样本制备的策略制备蛋白的目的活性分析免疫印迹杂交免疫沉淀或共沉淀1D2DEMSACHIP等实验材料细胞组织固定组织或石蜡包埋组织微生物酵母植物提取RNA后的剩余的蛋白样本等目的蛋白的结性质与分布分布于胞桨/胞核/膜可溶/不可溶含量多少分

3、子量大小四级结构特征磷酸化等修饰……方法的选择1自行配制抽提试剂,根据文献方法或经验提取2购买商品化试剂盒,按其说明书的方法提取CompanyLogo三案例分析--细胞中总蛋白的制备高速离心收集上清即得全蛋白样本细胞加入裂解液冰上放置10-15分钟蛋白定量和SDS-PAGE检测裂解样品离心收集定量检测CompanyLogo细胞裂解液-RIPABuffer的配方分析及技术要点表面活性剂缓冲液蛋白酶抑制剂磷酸酶抑制剂其它：H2O、NaCl、等还原剂RIPABufferCompanyLogo细胞裂解液-RIPABuffer的配方分析

4、及技术要点缓冲液Tris-HCl（pH7.5),提供pH环境，使蛋白保持稳定，增加溶解性。CompanyLogo细胞裂解液-RIPABuffer的配方分析及技术要点表面活性剂溶解膜与脂膜，溶解与稳定蛋白质（特别是膜蛋白）分为离子型（如SDS、脱氧胆酸盐等）和非离子型（如NP-40、Triton-100、tween系列等）。CompanyLogo各类表面活性剂特点1阴离子型:SDS脱氧胆酸盐2阳离子型:CPB和CTAB3双性离子型:CHAPSZwittergent系列4非离子型:Brij系列Triton-100NonidetP4

5、0Tween系列等CompanyLogo选用表面活性剂考虑的因素参考文献报告保持生物活性时使用的表面活性剂选用表面活性剂考虑的因素工作条件下表面活性剂的溶解性使用分子生物学级的表面活性剂,无核酸酶蛋白酶等根据样本下游的应用来选择表面活性剂的种类考虑表面活性剂的去除方法表面活性剂的纯度影响提取蛋白的质量保护蛋白活性时,不仅考虑表面活性剂的种类还有浓度尽量使用毒性较低的表面活性剂因不明原因某些蛋白适用专门的表面活性剂进行分离使用非表面活性剂NDSB结合表面活性剂来增加膜蛋白溶解性有时比较难仅一种表面活性剂既能溶解蛋白又适用于蛋白分

6、析,常先用一种表面活性剂将蛋白溶解,而另一种表面活性剂取代进行蛋白的后续分析CompanyLogo去除未结合的表面活性剂1疏水吸附方法HydrophobicAdsorption2透析法Dialysis3凝胶层析法GelChromatography4离子交换层析Ion-exchangeChromatography根椐表面活性剂的疏水性,CMC,凝聚数目,和电荷等性质来去除.CompanyLogo细胞裂解液-RIPABuffer的配方分析及技术要点蛋白酶抑制剂抑制蛋白酶的活性，防止蛋白被水解，使用前临时加入CompanyLogo蛋

7、白酶抑制剂及其鸡尾酒CompanyLogo细胞裂解液-RIPABuffer的配方分析及技术要点磷酸酶抑制剂抑制磷酸酶的活化，防止蛋白样本脱磷酸化，使用前临时加入。CompanyLogo磷酸酶抑制剂选择磷酸酶主要包括非特异性的磷酸酶（例如：碱性磷酸酶，酸性磷酸酶），特异性的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶（例如：PP1,PP2A,PP2B）、酪氨酸蛋白磷酸酶（例如：PTP）。常规的抑制剂主要包括：试剂名称抑制作用氟化钠酸性磷酸酶，丝氨酸/苏氨酸磷酸酶正钒酸钠碱性磷酸酶，酪氨酸蛋白磷酸酶焦磷酸钠丝氨酸-苏氨酸磷酸CompanyLogo细胞裂解

8、液-RIPABuffer的配方分析及技术要点还原剂防止蛋白质发生氧化，保护二硫键。DTT、β－巯基乙醇等。.CompanyLogo细胞裂解液-RIPABuffer的配方分析及技术要点其它水；溶剂NaCl：CompanyLogo全蛋白抽提时注意事项可以适量加入甘油,稳定蛋白注意