果梅ccoaomt蛋白western-blot体系建立与优化

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1、果梅CCoAOMT蛋白Western-blot体系建立与优化张勇侍嫿吴M高志红南京农业大学园艺学院摘要：［目的］本文旨在建立一套适合于果梅（Prunusmumc）Western-blot的蛋0质提取和技术体系。［方法］以果梅品种‘小绿萼’花芽为试验材料，以咖啡酰辅酶A-0-甲基转移酶（CCoAOMT）为目标蛋白，分别采用Tris-HCl法和SDS上样缓冲液直接提取法，比较2种提取方法的优劣，并通过设置不同的蛋白上样量（20、30、40、50及60ug）、转膜吋间（40、60及90min）、一抗稀释比例（1:500、1:1000、1

2、:2000及1:5000）以及一抗孵育时间（室温1h、室温2h及4°C过夜）等组合，研究适合果梅花芽CCoA0MT蛋白Western-blot的最桂体系。［结果］成功建立了快速、灵敏、特异的Western-blot体系，确定了果梅花芽CCoAOMT蛋白的Western-blot试验条件。SDS上样缓冲液直接提取法提取蛋白快速、高效，最佳条件为以蛋白上样量30ug、转膜1h、一抗稀释比例1:1000以及一抗孵育2h。［结论］本试验建立了简单、快速和重复性好的SDS上样缓冲液直接提取法以及优化的上样量、转膜时间和抗体浓度等Wester

3、n-blot体系，为梅等木本植物开展Western-blot研宄提供依据。关键词：果梅;花芽;蛋白提取;咖啡酰辅酶A-0-甲基转移酶（CCqAOMT）;Western-blot;作者简介：张勇，硕士研宄生。作者简介：高志红，教授，主要从事果树生物技术研究，E~mai1:gaozhihong@njau.edu.cno收稿日期：2017-02-13基金：国家Fl然科学基金项FI（31500571）EstablishmentandoptimizationofWestern-blotsystemforCCoAOMTproteininPru

4、nusmumeZHANGYongSHITingWUXinxinGAOZhihongCollegeofHorticulture，NanjingAgriculturalUniversity;Abstract：[Objectives]ThepaperaimstoestablishthemethodwhichisappropriateforproteinextractionandWestern-blotanalysisofPrunusmume.[Methods]WeusedflowerbudsofPrunusmume‘Xiaoltie’a

5、stheplantmaterialandPmCCoAOMTasthetargetprotein.Tris-HClmethodandSDSloadingbuffermethodwereusedtoextractflowerbudprotein,respectively.Furthermore,weanalyzedadvantagesanddisadvantagesoftwomethodsbycomparingTris-HClmethodwithSDSloadingbuffermethod.Inordertostudytheoptim

6、umWcstcrn-blotsystemforCCoAOMTproteinofJapaneseapricot,differentweightsofproteinsamples(20，30，40,50and60yg),transmembranetime(40，60and90min)，primaryantibodyconcentration(1:500，1:1000，1:2000and1:5000)andincubationtimeofprimaryantibody(atroomtemperaturefor1h,atroomtempe

7、rature2handat4°Cforovernight)weretested.[Results]Therapid,sensitiveandspecificWestern-blotsystemhasbeenestablishedsuccessfully,andtheexperimentalWestern-blotconditionofCCoAOMTproteinintheflowerbudofJapaneseapricotwasdetermined.SDSloadingbufferextractionmethodwasmorera

8、pidandefficient.Theoptimalconditionswereweightofproteinsamples(30ug)，transmembranetime(1h)，primaryantibodyconcentration(1:10